[發(fā)明專利]同位素13C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010183169.7
• 申請(qǐng)日: 2010-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN101864436A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜巨全;李士龍;徐偉慧;王志剛;于丁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12P13/24
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及4-羥基脯氨酸的合成方法。

背景技術(shù)

腎結(jié)石最普遍的形式是草酸鈣結(jié)石，占所有病例的80％。草酸的前體是乙醛酸。乙醛酸的水平正常情況下保持在一個(gè)平衡水平。它這種平衡水平是通過兩種重要的(酶丙氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶和乙醛酸脫氫酶)將乙醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖妓帷＿@樣，乙醛酸不能在體內(nèi)大量積累。而當(dāng)乙醛酸大量積累，就會(huì)增加形成草酸機(jī)會(huì)。研究表明4-羥基脯氨酸是在體內(nèi)能夠被降解成乙醛酸。有報(bào)道顯示，隨著人體攝入4-羥基脯氨酸的提高，尿中的草酸含量也隨之大量能夠增加，形成結(jié)石的幾率相應(yīng)增加。因此，研究4-羥基脯氨酸在體內(nèi)的代謝以及4-羥基脯氨酸對(duì)產(chǎn)生乙醛酸的影響程度對(duì)于了解腎結(jié)石的成因具有重要意義。通過對(duì)4-羥基脯氨酸代謝的研究還可以通過控制4-羥基脯氨酸的攝入量、以及研究有關(guān)藥物抑制4-羥基脯氨酸氧化酶，以達(dá)到降低從4-羥基脯氨酸生成乙醛酸的幾率，從而降低草酸形成的幾率達(dá)到預(yù)防和控制腎結(jié)石的目的。然而，在使用¹²C組成的4-羥基脯氨酸研究4-羥基脯氨酸的代謝過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞或人體本身能夠大量合成該物質(zhì)，而且¹²C組成的乙醛酸來自很多途徑，這就使我們不能準(zhǔn)確地計(jì)算4-羥基脯氨酸的代謝對(duì)乙醛酸生成的貢獻(xiàn)率。如果我們不能確定4-羥基脯氨酸到底能夠?qū)Ξa(chǎn)生乙醛酸，繼而產(chǎn)生草酸有多大程度影響，對(duì)于從控制4-羥基脯氨酸的代謝的角度控制腎結(jié)石就沒有任何意義。這是¹²C的4-羥基脯氨酸在實(shí)際應(yīng)用中的弊端。¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸則很好的克服了這一難題，正常情況下細(xì)胞乃至人體只能合成¹²C組成的4-羥基脯氨酸，在代謝過程中，無論來自何種途徑，只能產(chǎn)生¹²C組成的乙醛酸；因此，如果在培養(yǎng)細(xì)胞或讓人體攝入¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸，檢測(cè)¹³C標(biāo)記的乙醛酸，以及¹³C標(biāo)記的乙醇酸、草酸，然后計(jì)算比率，我們就能準(zhǔn)確地分析4-羥基脯氨酸對(duì)乙醛酸乃至草酸生成的貢獻(xiàn)率。但是目前為止，沒有任何可供研究使用的商業(yè)化的¹³C標(biāo)記的羥基脯氨酸。

目前4-羥基脯氨酸的制備方法，采用傳統(tǒng)的膠原蛋白工業(yè)化酸水解、純化法：哺乳動(dòng)物的膠原蛋白富含化合態(tài)4-羥基脯氨酸，在體內(nèi)它是通過脯氨酰-4-羥基化酶以脯氨酰-L-脯氨酸為底物合成的，因此商業(yè)化的該產(chǎn)品多通過酸水解膠原蛋白，然后純化獲得的；但是該方法不足之處是獲得的4-羥基脯氨酸全部是¹²C組成的4-羥基脯氨酸，而且純化工藝復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)。

采用微生物合成方法：Shiasaki等從指孢囊菌(Dactylosporangium?sp.strainRH1)大量篩選分離到能夠?qū)⒂坞xL-脯氨酸合成4-羥基脯氨酸；他們將其在大腸桿菌中表達(dá)，并且對(duì)大腸桿菌的ProB變成ProB⁷⁴，最終獲得能夠用于以葡萄糖或L-脯氨酸為底物發(fā)酵生產(chǎn)4-羥基脯氨酸的大腸桿菌工程菌株；該方法已被用于合成4-羥基脯氨酸；然而，該方法與上一方法相比，雖然在后期純化更加方便了，但是仍然只能主要用于生產(chǎn)¹²C組成的4-羥基脯氨酸。這是因?yàn)榧词箤⒌孜镒兂?sup>13C標(biāo)記的葡萄糖或L-脯氨酸，能夠合成¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸，但缺點(diǎn)是如以¹³C標(biāo)記的葡萄糖為底物后期純化太復(fù)雜，產(chǎn)生的¹³C標(biāo)記的物質(zhì)太多，而如以¹³C標(biāo)記的L-脯氨酸為底物，在大腸桿菌內(nèi)合成¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的同時(shí)，¹³C標(biāo)記的L-脯氨酸會(huì)被大腸桿菌內(nèi)具他酶降解，造成不必要的浪費(fèi)，¹³C標(biāo)記的L-脯氨酸本身價(jià)格昂貴，約合1500美元/克，因此該方法不適用于合成¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有制備4-羥基脯氨酸的方法不適用于合成¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的問題，而提供同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法。