[發(fā)明專利]同位素13C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010183169.7
• 申請(qǐng)日: 2010-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101864436A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜巨全;李士龍;徐偉慧;王志剛;于丁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02;C12P13/24
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

1.同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法，其特征在于同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法按以下步驟進(jìn)行：一、對(duì)指孢囊菌中編碼L-脯氨酸的4-羥基化酶的基因phy-1的原始序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得優(yōu)化的phy-1基因；二、優(yōu)化的phy-1基因與經(jīng)改造的原核表達(dá)載體pET19分別經(jīng)NdeI和BamHI進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET19-pp-histag-phy-1，然后RNA聚合酶插在DE3上的大腸桿菌C41中進(jìn)行蛋白高效表達(dá)及純化，獲得純化后的L-脯氨酸的4-羥基化酶；三、純化后的L-脯氨酸的4-羥基化酶進(jìn)行酶學(xué)合成反應(yīng)，生成反應(yīng)產(chǎn)物，然后進(jìn)行純化，獲得¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸，即完成同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成；其中步驟三中酶學(xué)合成反應(yīng)的體系由480mM的MES緩沖液、24mM的¹³C標(biāo)記的L-脯氨酸、48mM的2-酮戊二酸、12mM的硫酸亞鐵、24mM的L-抗壞血酸和1.2mg/mL純化后的L-脯氨酸的4-羥基化酶組成；步驟三中酶學(xué)合成反應(yīng)的溫度為35℃，pH值為6.5。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法，其特征在于步驟二中酶切的體系如下：

成分?????????????????????????????????????????用量

10×緩沖液???????????????????????????????????10μL

10U/μL?NdeI?????????????????????????????????2μL

10U/μL?BamHI????????????????????????????????2μL

1μg/μL優(yōu)化的phy-1基因/原核表達(dá)載體pET19????10μL

去核酸酶的純凈水?????????????????????????????76μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素¹³C標(biāo)記的4-羥基脯氨酸的生物合成方法，其特征在于步驟二中連接體系如下：

成分??????????????????????????????????用量

10×緩沖液????????????????????????????1μL

100ng/μL雙酶切后優(yōu)化的phy-1基因??????1μL

100ng/μL雙酶切后原核表達(dá)載體pET19????????5μL

10U/μL?T4連接酶??????????????????????????1μL。