[發明專利]利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法

無效

• 申請號: 201010183167.8
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN101864466A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 王建軍
• 申請（專利權）人: 成都圣凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 成都天嘉專利事務所(普通合伙) 51211
• 代理人: 趙麗

1.一種利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法，其特征在于工藝步驟如下：

A、工程菌株BL21-DE3的增菌發酵

按大腸桿菌的常規發酵條件及方法，將初始菌種接種入種子罐，TSB為基礎培養液，30℃下通氣培養5小時后轉入生產罐仍以TSB為基礎培養液，調節PH值至7.0，30℃下通氣培養12小時；

B、發酵液中添加色氨酸底物后進行的次生代謝發酵

在步驟A增菌發酵12小時之后，于發酵液中加入溶解在pH7.8磷酸緩沖液中的色氨酸溶液，使色氨酸最終濃度達到50％；，同時加入3～5g/L的吐溫60阻滯菌體增殖，在發酵罐中通氣1-2小時后停止轉化，通氣量1L/min，溫度為35℃，并用HPLC檢測反應進程；

C、發酵液中色氨酸/5-羥基色氨酸含量的監控

用反相色譜柱DIMONDC18(5μm，4.6X?250ram)，檢測波長為280nm，流動相為甲醇∶水＝15∶85(v/v)，流速為1.0mL/分鐘，進樣量為20μl，靈敏度0.01AUFS，柱溫為室溫；以色譜峰面積積分值對濃度進行回歸，得線性方程Y＝-258332+1.308413×106X(r＝0.9991)，RSD＝0.68％，5-羥基色氨酸含量在0.8-4g/ml范圍內，含量與峰面積積分值呈良好的線性關系；

D、發酵液5-羥基色氨酸的分離純化

發酵液停止轉化后，離心收集上清液，調節pH值至5.9，收集沉淀，以30％碳酸鈉溶液溶解，溶液以HPD-400大孔吸附樹脂對5-羥基色氨酸富集，上柱條件：濃度為1.5mg/ml的5-羥基色氨酸，以500ml/分鐘的速度通過HPD-400大孔吸附樹脂柱，上樣體積與濕樹脂的質量之比為2∶1，40％乙醇以500mL/min的流速洗脫，洗脫液體積與濕樹脂的質量之比為20∶1；洗脫液再經直接過聚酰胺樹脂分離除去底物L-色氨酸，上柱條件：濃度為1.0mg/ml的5-羥基色氨酸，以200ml/分鐘的速度通過聚酰胺柱，5-羥基色氨酸與聚酰胺樹脂的重量比為0.25∶1，上樣體積與濕樹脂的質量之比為2∶1，20％乙醇以200mL/min的流速洗脫；洗脫液真空濃縮后，再將濃縮液的醇濃度調整到35％，在5～15℃的溫度下1～3天結晶完全得5-羥基色氨酸產物。

2.如權利要求1所述利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法，其特征在于：步驟D所述5-羥基色氨酸第一次結晶物的純度＞90％，重結晶后的純度＞95％。

3.如權利要求1所述利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法，其特征在于：所述工程菌株BL21-DE3由家兔Oryctolagus?cuniculus色氨酸羥化酶基因構建重組表達載體，通過質粒轉化得到。

4.如權利要求1或3所述利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法，其特征在于：所述工程菌株BL21-DE3的具體制備方法如下：

純化提取來自兔腦組織勻漿基因組DNA，利用文獻“Proc?NatlAcad?Sci?USA.1987?Aug；84(16)：5530-4”報道的家兔Oryctolagus?cuniculus色氨酸羥化酶基因序列設計引物進行克隆，克隆片段用BamHI內切酶酶切，優化酶切條件，使酶切獲得的片段在1kb-6kb之間；回收這些片段，連入到通過同樣處理的pUC18質粒上，連接產物轉化大腸桿菌E.coli?DH5a，轉化后涂色氨酸顯色平板，篩選獲得一株具有明顯水解活力的克隆，提取質粒，BamHI酶切表明插入重組質粒上來自基因組的片段為3kb，測序表明在該片段上有一個完整的ORF閱讀框架，測序表明該基因與文獻報道的兔色氨酸羥化酶基因具有同源性。利用上述基因序列設計PCR模板，構建PET30質粒，將構建好的質粒通過電轉化法導入大腸桿菌E.coilBL21-DE3，獲得轉基因菌株。