[發明專利]利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法

無效

• 申請號: 201010183167.8
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN101864466A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 王建軍
• 申請（專利權）人: 成都圣凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 成都天嘉專利事務所(普通合伙) 51211
• 代理人: 趙麗

技術領域

本發明屬于生物遺傳工程領域，具體涉及一種將色氨酸羥化酶基因通過質粒轉化的方式轉入菌株BL21-DE3，以及應用該菌株發酵得到5-羥基色氨酸的方法。

背景技術

生物轉化是以微生物或酶作為催化劑，以可再生資源取代不可再生資源，大規模生產人類所需的化學品、醫藥、能源、材料等的有效手段。

5-羥基色氨酸(5HTP)是人體中重要的神經遞質5-羥色胺的前體，5-羥色胺是腦部分泌的一種荷爾蒙，會影響我們的情緒、睡眠和食欲，造成腦中的血清素不平衡時需5HTP來維持身體處于正常狀態。因此5HTP含量太低則容易憂郁、焦慮及睡眠失調。百憂解這類的抗抑郁癥藥物，就是通過防止腦細胞太快耗盡血清素，進而導致5-羥色胺不足來達到治療目的的。但是，如果能夠通過外源性的補充5HTP，即可在人體中制造出血清素，從而對維持神經正常的重要物質和腦的功能都有幫助。同時，血清素還可以幫助睡眠，并且可以有效的控制疼痛。因此5HTP也成功地被用來治療睡眠失調。還有，由于血清素是褪黑激素(一種調節睡眠和清醒周期的天然荷爾蒙)的前體，因此當血清素的含量提高時，褪黑激素的含量也相應增加，使得睡眠更為香甜。所以，5HTP是一種天然而且安全的治療和預防抑郁癥的有效化學物。

既然5HTP和SSRI(抗抑郁藥物)的作用類似，那么顯然服用5HTP有很多后者無法替代的好處，一是抗憂郁處方藥大多比較昂貴；其二，處方藥常會引起一些不良的副作用，包括口干、焦慮及喪失性欲等等。因此，5HTP在歐美已成為最重要的抗抑郁補劑和非處方藥物。

傳統的5HTP生產方法包括兩種，一種是從豆科植物尤其是原產非洲的加納籽(Griffonia?Simplicifolia)中提取。如CN101648900專利中報道了以非洲產加納籽為原料，超臨界萃取除油，除油后物料用水與醇類溶劑的混合溶液提取3-5次，合并提取液，經超濾后用離子交換樹脂吸附，洗脫，真空濃縮，低溫結晶后得到高純度5HTP干粉。

該工藝是目前5HTP生產的主流工藝，工藝條件穩定，除醇和水之外沒有其它有機溶劑污染，產品純度高。但是，該工藝生產成本完全依賴于原料加納籽的產量和采收期，年度生產不穩定，而且隨著近年來非洲地區原料采收成本的增加，價格逐年走高，導致5HTP生產成本居高不下，維持在1400元/公斤左右。

另一種工藝是CN101323586報道的以色氨酸和羥基乙酸為原料，在高壓反應釜中進行化學羥化反應獲得多羥基色氨酸，然后以色氨酸酶為催化劑在堿性條件下水解獲得5HTP的工藝。該工藝反應步驟多，獲得5HTP的條件不穩定，需要嚴格的拆分純化條件，而且反應過程中能耗巨大，因此一直未能實現中試規模的生產。

人體和其它哺乳動物體內合成5HTP的路徑是以色氨酸為底物，在體內色氨酸羥化酶的作用下特異性的生成5HTP。國內外已有報道對動物體內色氨酸羥化酶基因克隆并測定DNA序列及其蛋白序列。因此，在CDNA文庫中篩選相應的基因序列并利用成熟的質粒轉化方法將該基因導入工程菌株進行大規模發酵生產，將使我們在體外獲得大量的色氨酸羥化酶并由此以色氨酸為底物生產5HTP成為可能。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法。該工程菌株是利用已有報道的家兔Oryctolagus?cuniculus色氨酸羥化酶基因構建重組表達載體，通過質粒轉化而得到。本發明只需進行一步發酵，在不純化色氨酸羥化酶的條件下，即可獲得最終產物5-羥基色氨酸，且轉化率大于70％，收率大于80％。

本發明采用的具體技術方案如下：

一種利用工程菌株BL21-DE3發酵獲取5-羥基色氨酸的方法，其特征在于工藝步驟如下：

A、工程菌株BL21-DE3的增菌發酵

按大腸桿菌的常規發酵條件及方法，將初始菌種接種入種子罐，TSB為基礎培養液，30℃下通氣培養5小時后轉入生產罐仍以TSB為基礎培養液，調節PH值至7.0，30℃下通氣培養12小時。

B、發酵液中添加色氨酸底物后進行的次生代謝發酵

在步驟A增菌發酵12小時之后，于發酵液中加入溶解在pH7.8磷酸緩沖液中的色氨酸溶液，使色氨酸最終濃度達到50％(w/w)，同時加入3～5g/L的吐溫60阻滯菌體增殖，在發酵罐中通氣1-2小時后停止轉化，通氣量1L/min，溫度為35℃，并用HPLC檢測反應進程。

C、發酵液中色氨酸/5-羥基色氨酸含量的監控