[發明專利]乳腺癌干細胞分離純化方法

無效

• 申請號: 201010183122.0
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN102260647A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 盧英
• 申請（專利權）人: 盧英
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 金輝

技術領域

本發明涉及癌癥干細胞的分離純化方法，具體涉及一種采用免疫磁珠將乳腺癌干細胞從乳腺癌腫瘤組織中分離純化的方法，屬于生物醫藥領域。

背景技術

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤。在其治療過程中，復發是影響療效的重要因素，而造成復發的原因，目前普遍認為是手術治療中乳腺癌細胞的殘留，化療耐藥和放療、內分泌等治療不敏感的乳腺癌細胞殘存。

近年提出的癌干細胞(cancer?stem?cells，CSC)學說又為乳腺癌轉移提供了新的理論依據。該學說認為在腫瘤組織中只有少部分細胞不斷地增殖，而大部分腫瘤細胞處于不增殖或有限增殖的狀態，只有CSC才是腫瘤產生和發展的主要因素。進一步研究認為，CSC是來自正常干細胞，也可能來自于分化了的后代細胞，CSC應當擁有自我更新能力和維持惡性生長的特性。最近的研究證實，在白血病、腦瘤、肺瘤和乳腺癌中只有極少一部分細胞具有發生腫瘤和維持腫瘤能力的CSC。最新白血病CSC研究顯示，CSC比它們產生出來的快速生長后代細胞具有休眠性和更強的自我復制能力。因此，如能干預、阻止CSC的分化、增殖等病理生理過程，從而清除CSC，對提高惡性腫瘤的治療效果和降低腫瘤的復發意義重大。

乳腺癌是由許多形態上和功能上相當不同的細胞組成，Michael?Clarke實驗室已經證明9個病人中有8個病人擁有ESA+CD44+CD24-lin-腫瘤干細胞，這些細胞可以在小鼠中產生腫瘤，而注射100倍的不表達同樣抗原的其他乳腺癌細胞亞群并不能形成腫瘤，更為令人信服的是這些在小鼠上產生的腫瘤細胞可以在別的小鼠上繼續傳代產生腫瘤，這些腫瘤同他們的原發腫瘤一樣，包含腫瘤干細胞和由他們產生的惡性乳腺癌細胞.這個研究從根本上證實了CSC在乳腺癌中存在并可發展成乳腺癌。2002年，Clarke等首次從乳腺癌組織中分離CSC，他們把乳腺癌乳房切除手術后的標本制成單細胞懸液，經流式細胞儀篩選出表達CD44、B38.1、ESA的細胞，擴增后注入NOD/SCID小鼠體內，小鼠長出了腫瘤，證明這部分細胞具有腫瘤源性；隨后AL-Hajj等從乳腺癌患者體內分離出表達的細胞，這部分細胞具有正常干細胞的特征，能夠無限增殖，并能分化成為多種組織類型的細胞，后者增殖能力有限，由此證實了乳腺癌干細胞存在的證據。

乳腺癌干細胞是一群CD44⁺、CD24^-的特異細胞群，經過研究表明乳腺癌干細胞大多存在于乳腺腫瘤組織及乳腺相關的癌細胞中。如何獲取一定數量的乳腺癌干細胞進行檢測是研究者面臨的另一個技術瓶頸。乳腺癌干細胞在腫瘤組織中的比例只有約2-5％，不經過富集難以滿足需要，因此CSC檢測的臨床應用主要存在以下問題：

首先，目前尚未發現乳腺癌CSC特異標志物，現在運用的檢測標志尚存在某些缺陷，目前還難以在臨床運用，尋找特異敏感的檢測標志對于其臨床應用至關重要；

其二，乳腺癌癌癥干細胞的現有分離方法，非常復雜，需要昂貴的流式細胞儀和非常有經驗的專業技術人員，且要經過動物實驗驗證后，才能確定，而且需耗時1-2年以上，約花費數十萬元才能完成。

現有技術中，應用密度梯度離心法或流式細胞儀等方法富集腫瘤細胞均存在純度不高、儀器設備昂貴、影響細胞活力等去缺陷，因此在實際工作中難以廣泛應用。

免疫磁珠分選系統(Magnetic?Cell?Sorting，MACS)是一種新興的細胞分離技術，被廣泛用于細胞分離，蛋白質，核酸純化等諸多領域，目前MACS已用于干細胞研究，免疫磁性分離法是基于細胞表面抗原以及某種蛋白與連有免疫磁珠的特異性單抗相結，在外加磁場的條件下，通過抗體與免疫磁珠相連的細胞和某種蛋白被吸附而滯留在磁場中，由于免疫磁珠表面的單抗只結合含有特異性抗原的細胞和蛋白，從而達到與其他種類的細胞和蛋白相分離的目的。應用免疫磁性分離技術分離細胞的方法有兩種：直接從細胞混合液中分離出靶細胞的方法，稱為陽性分離法；利用免疫磁珠去除無關細胞，使靶細胞得以純化的方法，稱為陰性分離法。應用陰性分離法只能對腫瘤細胞進行3～4倍的富集，而陽性分離法對腫瘤細胞的富集率則高的多，可對腫瘤細胞進行10³～1.5×10⁴倍的富集。