[發明專利]乳腺癌干細胞分離純化方法

無效

• 申請號: 201010183122.0
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN102260647A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 盧英
• 申請（專利權）人: 盧英
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 金輝

1.一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：所述分離純化方法用免疫磁珠分選系統分離乳腺腫瘤中的癌癥干細胞，包括以下三個步驟：

a.制備單細胞懸液；

b.免疫磁珠陰性分選，分離去除乳腺癌細胞中的正常細胞；

c.免疫磁珠陽性分選，純化乳腺癌干細胞。

2.根據權利要求1所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：a步驟為：將腫瘤樣品切成小塊，移送到酶溶液中，37℃水浴培養30～40分鐘，顯微鏡下檢測，若成細胞團或單個細胞，即加血清終止消化，無血清培養液清洗，離心除去上清，用MACS緩沖液重懸細胞，過45μm濾網得到懸浮單細胞，調整細胞密度至10⁷/ml。

3.根據權利要求1所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：b步驟為：將LINEAGE陽性抗體加入步驟a得到的細胞懸液，3～5℃孵育20～30分鐘后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混勻，放置20分鐘，用MACS緩沖液洗滌細胞兩次，離心去除多余的免疫磁珠，再用MACS緩沖液重懸細胞；用MACS緩沖液預洗LD磁性分選柱，將細胞懸液過柱，收集通過分選柱的細胞液，收集到的洗液為去除癌癥組織中正常細胞的腫瘤細胞。

4.根據權利要求3所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：所述LINEAGE陽性抗體包括CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD24，CD31中的一種或幾種。

5.根據權利要求4所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：加入LINEAGE陽性抗體的比例按每5μl抗體相對于2×10⁷個細胞/200μl細胞懸液。

6.根據權利要求1所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：c步驟為：將步驟b得到的細胞懸液離心，洗滌后重懸在MACS緩沖液中，將抗CD44抗體加入細胞懸液中，3～5℃孵育20～30分鐘，用MACS緩沖液洗滌細胞，離心去除多余的抗體，用MACS緩沖液重懸細胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4℃放置20分鐘，加MACS緩沖液沖洗，離心去除游離的兔抗鼠免疫磁珠，棄除上清，再以MACS緩沖液重懸細胞；用MACS緩沖液預洗LD磁性分選柱，將細胞懸液過柱，用MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標記細胞，移柱出磁場，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液，此為CD44陽性CD24陰性或弱陽性的乳腺癌腫瘤干細胞。

7.根據權利要求6所述的一種乳腺癌干細胞分離純化方法，其特征在于：加入抗CD44抗體的比例按1.5μl抗體相對于2×10⁶/100μl細胞懸液。