[發(fā)明專利]分子印記固相萃取-液相色譜測定體液中可天寧的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010182271.5
• 申請(qǐng)日: 2010-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN101963600A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡繼寶;楊俊;鄧宇;周平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南昌佳誠專利事務(wù)所 36117
• 代理人: 閔蓉;張建新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體液中可天寧的測定方法，特別是一種利用合成可天寧分子印記聚合物測定體液中可天寧的方法的方法。

背景技術(shù)

隨著全球性控?zé)熯\(yùn)動(dòng)的不斷推進(jìn)，社會(huì)公眾對(duì)于吸煙與健康問題日益關(guān)注。可天寧是尼古丁在人體代謝的主要產(chǎn)物，具有半衰期長、可從生物體液中準(zhǔn)確測定等優(yōu)點(diǎn)。尿液、血液和血漿、吐液中的可天寧，被認(rèn)為是一種特效、高靈敏、最可信的生物學(xué)標(biāo)記物，能反映人體通過吸煙或飲食攝入尼古丁劑量的大小。吸煙人群和非吸煙人群暴露于煙草煙氣的程度與其體液中檢測出的可天寧濃度存在良好的正相關(guān)關(guān)系。因此可天寧是合適的評(píng)價(jià)人體暴露煙草主流煙氣或環(huán)境煙草煙氣的生物標(biāo)記物。

目前測定人體體液中可天寧的分析方法包括分光光度法、氣相色譜-氮磷檢測法、離子阱質(zhì)譜法或電離源質(zhì)譜法、高效液相色譜(HPLC)紫外檢測法，HPLC原子力化學(xué)電離源質(zhì)譜法、柱前衍生化HPLC分析法、¹²⁵I放射免疫檢測法以及單克隆抗體酶免疫檢測法等。為了凈化或預(yù)濃縮被測樣品，幾乎所有的分析方法都采用包括液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)等樣品前處理技術(shù)。LLE過程煩瑣、費(fèi)時(shí)、消耗大量的有機(jī)溶劑、對(duì)操作者健康以及對(duì)環(huán)境造成不利影響。而針對(duì)復(fù)雜體系樣品，經(jīng)典SPE吸附劑又缺乏選擇性，無法快速、準(zhǔn)確的對(duì)人體體液中的可天寧進(jìn)行定量分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的正是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供一種分子印記固相萃取-液相色譜測定體液中可天寧的方法。該方法首先制備高選擇性的可天寧分子印記聚合物將體液中可天寧完全萃取，然后經(jīng)過固相萃取洗脫，從而實(shí)現(xiàn)其中可天寧的快速、準(zhǔn)確定量分析。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種分子印記固相萃取-液相色譜測定體液中可天寧的方法，依次包括以下步驟：

(1)將可天寧、單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑、生孔劑超聲脫氣、通氮?dú)夂竺芊猓谒∠戮酆希缓髮⒕酆衔镅心ァ⒑Y分，收集25-36μm的聚合物，用丙酮反復(fù)沉降去除細(xì)小顆粒后得到所需顆粒。將所需顆粒裝入玻璃層析柱中，分別用100mL-400mL的有機(jī)酸溶液和100mL-300mL醇淋洗，洗脫印跡聚合物中的模板分子可天寧。洗脫后的聚合物顆粒置于烘箱中干燥，得合成的可天寧分子印記聚合物。

(2)將合成的聚合物作為固相萃取吸附劑，稱取200mg-300mg裝填于3mL的SPE聚丙烯空柱(Supelco，Bellefonte，USA)中，制備固相萃取小柱。

(3)采用含有機(jī)酸、水的乙腈溶液、醇、緩沖溶液依次淋洗固相萃取小柱，采用緩沖溶液調(diào)節(jié)體液樣品pH后上樣，用緩沖溶液和有機(jī)胺的乙腈溶液淋洗小柱，去除體液樣品中的鹽及其它基體化合物，采用含有機(jī)酸、水的乙腈溶液對(duì)小柱進(jìn)行洗脫。

(4)分別收集步驟(3)淋洗、流出環(huán)節(jié)的溶液，濃縮至近干，加入乙酸鹽緩沖溶液，得檢測液。

(5)利用高效液相色譜測定步驟(4)所得檢測液中的可天寧。

色譜條件：色譜柱：Zorbax?SB-C18(250×4.6mm，5μm，Agilent公司)；流動(dòng)相：A相為緩沖鹽溶液，B相為乙腈，等度洗脫，洗脫比例：A∶B＝88％∶12％；流動(dòng)相中包含濃度為0.02mol/L庚烷基磺酸鈉作離子對(duì)試劑；流速：1.0mL/min；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長為260nm；進(jìn)樣量：20μL。

本發(fā)明中，所述體液可為尿液、血液、血漿或吐液。

所述步驟(1)中單體為包括一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子取代烷基的烯酸。交聯(lián)劑為包括一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子取代烷基的烯酸一元醇酯或多元醇酯。生孔劑為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子的一取代或多取代氯代烴；引發(fā)劑為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)烴基的一取代或多取代偶氮腈。

所述步驟(1)中脫氣時(shí)間為5-20min；通氮?dú)鈺r(shí)間為5-20min；水浴溫度控制在40℃-80℃；水浴時(shí)間為12h-36h。

所述步驟(1)的淋洗液中有機(jī)酸為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子的一元有機(jī)酸或多元有機(jī)酸。醇為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子的一元醇或多元醇。聚合物顆粒干燥溫度控制在100℃-150℃。干燥時(shí)間控制在12h-36h。

所述步驟(3)的含有機(jī)酸、水的乙腈溶液中有機(jī)酸為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子的一取代或多取代氟代有機(jī)酸；有機(jī)酸比例為1％-5％，水比例為1％-5％。

所述步驟(3)的調(diào)節(jié)固相萃取小柱的醇為一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)碳原子的一元醇或多元醇。