[發(fā)明專利]一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010181347.2
• 申請日: 2010-05-25
• 公開（公告）號: CN102002509A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);趙慶新;吳敬
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明設(shè)計(jì)一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在食品工業(yè)用酶的表達(dá)研究和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，用微生物表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)食品用酶，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)具有方便的來源，多年來很多研究機(jī)構(gòu)開發(fā)了多種系列的表達(dá)載體和表達(dá)宿主菌，而且在多方向?qū)Υ竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造。但是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的許多問題依然存在，如包含體的形成，大腸桿菌表達(dá)宿主菌的毒性問題。酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槟芙鉀Q部分真核來源異源蛋白表達(dá)的翻譯后修飾問題，具有獨(dú)特的優(yōu)越性，但酵母表達(dá)系統(tǒng)低表達(dá)效率的問題是其主要的缺陷。

枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要的優(yōu)點(diǎn)是：1)與革蘭氏陰性菌相比，無內(nèi)毒素，是GRAS，具有安全性。2)它有很多分泌信號肽，枯草桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)宿主菌可為重組蛋白的分泌提供充分的可選擇的分泌信號肽，使得目的蛋白的胞外表達(dá)成功效率更高，同時(shí)可以降低胞內(nèi)包涵體的形成概率，提高重組酶正確折疊的效率。3)芽孢桿菌是很多食品用酶的來源菌，該類酶在芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效果應(yīng)該更好，許多同源蛋白重組胞外表達(dá)的成功效率可以達(dá)到25g/L以上。

但目前枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)尚存在許多問題：

(Ⅰ)雖然許多枯草芽孢桿菌表達(dá)載體，已經(jīng)被構(gòu)建、改造和使用，但目前可供選擇的和可以高效率表達(dá)的載體和宿主細(xì)胞種類仍然是有限的，可改造性差，其可選擇性遠(yuǎn)低于大腸桿菌表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體。

(Ⅱ)啟動子的序列優(yōu)化，RBS序列的優(yōu)化，RBS序列和ATG之間的距離待于進(jìn)一步改進(jìn)。

(Ⅲ)質(zhì)粒穩(wěn)定性差，相對于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌細(xì)胞在復(fù)制中容易丟失質(zhì)粒。

(Ⅳ)信號肽對于重組蛋白的有效分泌，起著非常重要的作用，需要發(fā)現(xiàn)更加有效的信號肽和發(fā)現(xiàn)新的啟動子與信號肽組合，使得分泌功能更強(qiáng)，降低包涵體的形成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體。

本發(fā)明提供的表達(dá)載體，包括如下元件：人工設(shè)計(jì)的表達(dá)調(diào)控元件、枯草芽孢桿菌信號肽的編碼序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列、抗生素抗性基因。

所述表達(dá)載體具有以下1)或2)所示的DNA序列；

1)DNA序列為SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列；

2)與1)限定的DNA序列具有90％以上同源性。

所述人工設(shè)計(jì)的表達(dá)調(diào)控元件由枯草芽孢桿菌P43啟動子、枯草芽孢桿菌脫乙酰幾丁質(zhì)酶信號肽的編碼序列CSN、F1噬菌體的終止子序列，人工設(shè)計(jì)的能被枯草芽孢識別的核糖體結(jié)合序列序列RSB、人工設(shè)計(jì)的枯草芽孢桿菌信號肽酶的酶切位點(diǎn)、人工設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)MCS組成。

所述表達(dá)調(diào)控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；

3)其DNA序列為SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列；

4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列能夠雜交且能促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列；

5)與3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。

所述抗生素抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰蚝桶逼S青霉素抗性基因。

所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pMA5。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供所述表達(dá)的載體的應(yīng)用。

所述表達(dá)載體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的應(yīng)用。

所述表達(dá)載體在構(gòu)建基因工程菌株中的應(yīng)用。

所述表達(dá)載體促進(jìn)在目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的載體既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在枯草芽孢桿菌中復(fù)制并表達(dá)，豐富了可用于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的載體；該載體首次使用B.subtilis脫乙酰幾丁質(zhì)酶信號肽，其引導(dǎo)分泌胞外蛋白的能力較強(qiáng)，報(bào)告基因?yàn)闃?gòu)巢曲霉果膠酸裂解酶基因，其胞外表達(dá)量達(dá)到600U/mL，遠(yuǎn)高于果膠酸裂解酶基因使用其它載體時(shí)的表達(dá)水平。

附圖說明

圖1表達(dá)調(diào)控元件模型(P43/CSN/F1T)

圖2P43PCR電泳圖

圖3RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA(B)合成電泳圖

圖4P43-RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA合成電泳圖

圖5pBSCWZ表達(dá)載體物理圖譜

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1表達(dá)調(diào)控元件的設(shè)計(jì)