[發明專利]一種磁性熒光納米粒子標記家蠅神經細胞的方法

有效

• 申請號: 201010179854.2
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN101858908A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發明（設計）人: 周健;任天瑞;李興玉
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 楊杰民

技術領域

本發明屬于熒光標記細胞技術，具體說一種磁性熒光納米粒子標記家蠅神經細胞的方法。

背景技術

納米技術是20世紀80年代末90年代初逐步建立并發展起來一門新興的技術，并在21世紀得到了迅速發展。納米技術與生物技術、信息技術一起被看作是促進21世紀發展的三大重要技術。納米技術的應用前景貫穿了從以原子、分子為主體的微觀領域、微觀與宏觀的過渡區以及人類活動的宏觀世界。與此同時，納米尺度上的多學科交叉展現了納米技術巨大的生命力，迅速成為一個有廣泛和潛在應用前景的技術領域。1993年，國際納米科技指導委員會將納米技術劃分為6個分支：納米電子學、納米物理學、納米化學、納米加工學、納米計量學和納米生物學。

磁性熒光納米粒子不僅具有良好的超順磁性和表面易功能化等特點，而且利用熒光可以定向識別并標記目標物質。磁性熒光粒子表面引入如-OH、-COOH、-CHO、-NH₂等多種反應性功能基團，還可以通過共價鍵結合配體，使其與生物受體特異性結合從而在熒光顯微鏡下觀測其形態。

目前，熒光標記技術使用的熒光素是異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、德克薩斯紅、羅丹明等。現有技術熒光標記蛋白質Marsshall法，利用蛋白質上的賴氨酸與熒光染料的N＝C＝S鍵結合形成復合物從而發出熒光。現有技術的缺點是賴氨酸與熒光染料的N＝C＝S鍵結合反應必須在pH8-9的堿性條件下進行，一旦環境條件和pH值改變，熒光素很容易從蛋白質上解離下來，使得在熒光顯微鏡下難以準確觀測其形態。

因此發明一種利用磁性熒光納米粒子與生物受體結合，在中性條件下進行熒光標記；保持熒光素長期穩定的發光，提高標記效率，使得在熒光顯微鏡下準確觀察其形態的磁性熒光納米粒子標記家蠅神經細胞的方法是十分重要的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用磁性熒光納米粒子與生物受體結合，在中性條件下進行熒光標記；保持熒光素長期穩定的發光，提高標記效率；使得在熒光顯微鏡下準確觀察其形態的磁性熒光納米粒子標記家蠅神經細胞的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

一種磁性熒光納米粒子標記家蠅神經細胞的方法，步驟如下：

(1)制備磁性熒光納米粒子復合物：

A稱取表面已修飾氨基的磁性熒光納米粒子，加入pH值6.5-7.5的磷酸緩沖液，超聲分散5-15min；

B向步驟A產物中加入0.1-0.5mol/L的N，N-二環己基碳酰亞胺縮合劑；37℃孵育10-25min；

C向步驟B產物加入0.05-0.5mol/L的γ-氨基丁酸溶液，37℃孵育10-20min；

D將步驟C產物加入磁場，依次用N，N-二甲基甲酰胺和雙蒸水洗滌磁粒2遍；

E將步驟D所得磁粒加入青霉素和鏈霉素混合液，-20℃保存備用；

(2)制備家蠅神經細胞懸液：

A取活的家蠅成蟲，置于4℃冰箱中放置5-8分鐘，浸入75％的酒精消毒；

B將消毒過的家蠅，平放在表面皿上，切去頭，收集家蠅頭顱；

C將家蠅頭顱置入pH6.5-7.5的磷酸緩沖液，制成家蠅神經細胞懸液后通過80目篩，濾液備用；

(3)磁性納米粒子標記家蠅神經細胞：

A向家蠅神經細胞懸液，加入配體的磁性熒光納米粒子復合物雙抗懸濁液；置于37℃、飽和濕度、5％C0₂培養箱中孵育15-30min；

B磁場下棄去清液，用pH6.5-7.5的磷酸緩沖液洗滌磁粒2次；

C向上述磁粒加入pH6.5-7.5的磷酸PBS緩沖液、搖勻、制片、吹干，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

本發明的要點是制備磁性熒光納米粒子復合物，在中性條件下通過熒光標記家蠅神經細胞表面的配體γ-氨基丁酸受體蛋白而標記家蠅的神經細胞。

本發明磁性熒光納米粒子復合物制備路線如下圖所示：

首先在N，N-二環己基碳酰亞胺DCC催化下氨基修飾的磁性熒光納米粒子與配體γ-氨基丁酸GABA結合形成復合物；

然后利用磁性熒光納米粒子復合物標記并分離家蠅的神經細胞；標記過程在pH＝6.5-7.5的磷酸緩沖液媒介中進行。

本發明熒光標記細胞的方法是通過熒光標記細胞壁表面特定的蛋白質而實現對整個細胞的熒光標記。

本發明使用的配體γ-氨基丁酸GABA的濃度為0.05-0.5mol/L；N，N-二環己基碳酰亞胺縮合劑DCC的濃度為0.1-0.5mol/L；粒子孵育時間為10-30min。