[發(fā)明專利]一種新型殼聚糖納米顆粒及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010179253.1
• 申請(qǐng)日: 2010-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN101838467A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾曉雄;胡冰;王舒舒;孫怡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C08L89/00
• 分類號(hào): C08L89/00;C08L5/08;C08J3/24;C12P21/06;A23L1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及一種可用于食品工業(yè)中制備新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的方法。

背景技術(shù)

酪蛋白磷酸肽(Casein?Phosphopeptides，簡稱CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，經(jīng)單一酶或復(fù)合酶系水解，再經(jīng)分離純化而得到的含有成簇的磷酸絲氨酰基的肽，在動(dòng)物小腸內(nèi)能與Ca²⁺結(jié)合，阻止磷酸鈣沉淀，使小腸對(duì)Ca²⁺的溶解度大大增加。鈣、鐵、鋅在動(dòng)物體內(nèi)起著重要作用，由于飼料原料中含有大量植酸鹽、纖維素、糖醛酸、藻酸鈉和草酸等，從而阻礙了動(dòng)物對(duì)鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的吸收。CPP可提高鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)的溶解度從而促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收。另外，CPP對(duì)動(dòng)物免疫和繁殖也有著重要作用。

殼聚糖近年來被廣泛用做生物醫(yī)藥輸送載體，具有很好的生物可降解性、生物相容性和黏膜吸附性。殼聚糖納米顆粒能夠吸附到黏膜表面，并迅速打開上皮細(xì)胞之間緊密的黏結(jié)，避開腸道清除機(jī)制，在人體腸道中保留較長時(shí)間。完整的殼聚糖納米顆粒能夠被人體細(xì)胞吞噬，從而顯著提高被其包封的活性分子的生物利用率。大量毒理學(xué)研究已經(jīng)證明，殼聚糖對(duì)人體安全，無毒副作用。1992年日本將甲殼素及其衍生物列為功能性食品成分。因此，殼聚糖是非常理想的制備食品納米材料的原料，可以作為食品功能因子的安全輸送載體.目前通常使用三聚磷酸鈉交聯(lián)殼聚糖的方法制備殼聚糖納米顆粒。但是，作為口服輸送載體，殼聚糖納米顆粒不耐強(qiáng)酸，在低pH值條件下會(huì)迅速解離、降解，導(dǎo)致被輸送營養(yǎng)物在胃酸環(huán)境中遭破壞而不能被靶向輸送至腸道吸收。

本發(fā)明專利解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通過pH值選擇性沉淀以及陰離子交換分離、純化得到的富含磷酸基團(tuán)的酪蛋白磷酸肽。通過條件優(yōu)化，選擇合適的pH值條件、殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質(zhì)量比制備新型的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒。由于表面磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的作用，殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒在體內(nèi)能夠避免酸和酶的降解而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，具有一定的靶向和緩釋性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明專利利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通過等電點(diǎn)沉淀和陰離子交換樹脂分離純化功能性酪蛋白磷酸肽。由于表面磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的作用，酪蛋白磷酸肽在體內(nèi)能夠避免酸和酶的降解而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。本專利在國際上首次將制備得到的酪蛋白磷酸肽用于與殼聚糖相互交聯(lián)作用形成以酪蛋白磷酸肽聚集體為核，過量殼聚糖反吸附到其表面的“芯-殼”納米顆粒結(jié)構(gòu)。這種方法一方面提供了制備殼聚糖納米顆粒的新方法；另一方面，也為包封和保護(hù)生物活性多肽以及活性酶提供了一種溫和、高效而便捷的高分子納米材料。

附圖說明

圖1.隨著殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質(zhì)量比升高過程中，形成的納米顆粒透射電鏡圖

具體實(shí)施方式

1.稱取50g酪蛋白，加入0.05M的NaOH溶液500mL，用磁力攪拌器持續(xù)攪拌，待其充分溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.0。稱取胰蛋白酶0.25g，溶于0.75mL去離子水中。將胰蛋白酶溶液加入酪蛋白-氫氧化鈉溶液中，充分混勻，置于50℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)，并且不斷以1M的NaOH溶液調(diào)節(jié)水解液的pH，使水解液的pH恒定8.0。當(dāng)水解液的pH最后一次調(diào)回8.0后，保持半小時(shí)以上不再變化時(shí)，認(rèn)為反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后，將水解液以沸水浴5min滅酶。待水解液溫度回到室溫后，用1M的HCl將水解液的pH調(diào)至4.6，以2000r/min離心30min，取上清液，即為CPP粗提產(chǎn)物。調(diào)節(jié)CPP初產(chǎn)物pH值至pH8.9，通過HiPrep?column(16/10?QXL，Amersham?Biosciences)陰離子交換柱分離純化，并凍干得到富含磷酸基團(tuán)的酪蛋白磷酸肽。

2.將殼聚糖溶于1％的醋酸溶液，濃度為8mg/ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。

3.將酪蛋白磷酸肽以去離子水復(fù)溶，濃度為8mg/ml，以HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。

4、在500ml酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加殼聚糖溶液，直至殼聚糖與酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量比為1/5，溶液呈現(xiàn)明顯的乳光。

5、將納米顆粒溶液以20000g離心30分鐘，移除上清液，以含0.01M?NaCl的10mMTris-HCl緩沖液將納米顆粒沖洗三次之后，以pH2.5的HCl溶液將納米顆粒重新分散開。

6、將納米顆粒的鹽酸溶液凍干，制成凍干粉。