[發明專利]乙酰普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的制備方法

無效

• 申請號: 201010179030.5
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN101831000A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 張其清;唐紅波;李學敏;劉玲蓉;張彤;李磊;白永剛;周志敏
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院生物醫學工程研究所
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K47/36;A61K9/14
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術領域：

本發明涉及一種乙酰普魯蘭多糖葉酸偶聯物(Folate-conjugated?pullulan?acetate，FPA)的純化及其納米粒子(Folate-conjugated?pullulan?acetate?nanoparticles，FPAN)的制備方法。

背景技術：

納米藥物載體是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分布，控制藥物的釋放速度并將藥物輸送到靶向器官的納米級別的體系，理想的藥物輸送載體具有以下特征(Wim?H?DeJong，et?al.，Int?J?Nanomedicine.2008，3(2)：133-149；S.M.Moghimi，et?al.，FASEB?J.2005，19(3)：311-330；Karina?R，et?al.，Adv?Drug?Deliv?Rev.2008，60(8)：929-938)：能對藥物進行包封和很好地釋放、結構穩定、生物相容性好、低毒性和具有生物分布和靶向能力以及作用，另外，還需要輸送藥物后很好的生物降解性。靶向的藥物載體研究成為近年來研究的熱點，腫瘤分子靶向治療是指在腫瘤分子細胞生物學的基礎上，利用腫瘤組織或細胞所具有的特異性(或相對特異的)結構分子作為靶點，使用某些能與這些靶分子特異結合的抗體、配體等達到直接治療或導向治療目的的一類療法。這種治療方法具有較低的不良反應和良好療效，能明顯提高患者的生活質量，是現在腫瘤治療領域的突破性和革命性的發展，代表了腫瘤生物治療目前的最新的發展方向。葉酸是一種小分子量的維生索，其受體是一種糖蛋白，在人類癌癥，包括卵巢、大腦、腎、乳房、脊髓細胞和肺等的惡性腫瘤，葉酸受體高于正常水平；而在絕大多數正常組織中，幾乎不表達。利用葉酸對葉酸受體的高度親和性，可用于將藥物或載體材料與葉酸偶聯，將藥物靶向輸送至腫瘤。以葉酸(或其類似物)為配體，從小分子放射性顯像劑到大分子基因藥物都可與葉酸高效結合，并被轉運進入細胞，葉酸連接的載體材料對葉酸受體高表達的腫瘤細胞也具有明顯的靶向作用。

制備納米藥物載體的材料可以分為合成材料和天然材料，其中，多糖廣泛存在于自然界，是比較容易得到的一類重要的天然材料，含有羥基(-OH)、羧基(-COOH)和氨基(-NH2)等親水性基團，可反應基團較多，很容易被修飾和改性，生成很多種衍生物，已經被廣泛用于納米藥物及納米藥物載體的研究(Zonghua?Liu，et?al.，Adv?Drug?Deliv?Rev.2008，60(15)：1650-1662)。普魯蘭多糖(Pullulan)由于具有良好的耐酸堿性，可塑性強，成膜性好，透氣性低，無吸濕性，水溶液粘度明顯低于其它多糖溶液，近年來，科研人員逐漸認識到普魯蘭多糖的無毒，無致突變作用，良好生物相容性以及可生物降解性，可以作為一種良好的生物材料運用在藥物、基因遞送和組織工程等領域(R?RM?et?al.，Trends?Biomater?Artif?Organs，2007，20(2)：116-121；Leathers?TD，et?al.，Appl?Microbiol?Biotechnol.2003，62(5-6)：468-473；Shingel?KI，et?al.，Carbohydr?Res.2004，339(3)：447-460)。早在1986年，Motozato(Motozato?Y，et?al.，JChromatogra.1986，55：434-437)發現水溶性普魯蘭多糖經乙酰化改性可生成疏水性的乙酰普魯蘭多糖，這種物質容易通過溶劑揮發法制成微球。2003年，Jung等(Jung?SW，et?al.，Int?J?Pharm，2003，254(2)：109-121)發現改變醋酐和吡啶的投料量可制備出不同取代度的乙酰普魯蘭多糖，用透析方法可制備出不同粒徑的納米粒子，熒光探針法研究證明納米粒子是通過自組裝方法形成，臨界膠束濃度隨乙酰取代度增加而減小，此納米粒子包載疏水性藥物后可延緩藥物的釋放。將乙酰普魯蘭多糖與氨苯磺胺偶聯(PA/SDM)連接可形成pH敏感性納米凝膠顆粒(NaK，et?al.，J?Control?Release.2003，87(1-3)：3-13)，另外，本試驗室還將乙酰普魯蘭多糖采用溶劑擴散法制備納米粒子，并將其作為抗腫瘤藥物載體進行了研究(Zhang?H.Z，et?al.，Colloid?SurfB.2009，71(1)：19-26)，體外采用MTT法考察了其對正常成纖維細胞和Hela癌細胞的毒性。乙酰普魯蘭多糖結構中殘存的羥基還可以與配體結合形成靶向性載體材料，如引入生物素制成生物素受體靶向納米載體(Na?K，et?al.，Eur?J?Pharm?Sci.2003，18(2)：165-173)，對生物素受體高表達腫瘤細胞有特異靶向作用，細胞攝取納米粒子的量隨生物素取代度的增加而增加；我們的前期研究(Hui-zhu?Zhang，et?al.，Drug?Delivery，2010；17(1)：48-57)也已經成功合成了葉酸乙酰普魯蘭多糖偶聯物，并應用溶劑擴散法制備了納米粒子，試驗結果表明連接葉酸后的載藥納米粒子進入細胞主要通過葉酸受體途徑，提示葉酸偶聯納米粒子通過葉酸受體途徑進入細胞，可增加對腫瘤組織的選擇性，增強抗腫瘤療效，因而是一個很有發展前途的抗腫瘤藥物載體，但是，這種材料的合成有兩個步驟，如何將反應產物進行分離純化至關重要，另外，當合成的材料乙酰基取代度較低、葉酸取代度較高時，采用溶劑擴散法制備納米粒子，注入分散液中的針頭會帶有少量絮狀物，所制備的納米溶液乳光不強，納米懸液中有可見懸浮顆粒，高速離心(20000轉/分鐘，4℃，15min)后，溶液仍有有較強黃色，所收集到的納米粒子很少，大部分材料采用這種方法均不能成納米粒子。CN200810052708.6公開了葉酸受體介導靶向乙酰普魯蘭多糖納米粒子的制備。本發明在前期研究基礎上將產物應用常規試劑無水乙醇進行沉淀，碳酸鈉緩沖液進行透析來進行分離和純化，另外，通過透析法將這種材料制備納米粒子作為藥物載體，以上研究均未見任何文獻或專利報道。