[發明專利]沉默食管癌細胞HIF-1α基因29ShRNA表達載體的構建

無效

• 申請號: 201010178613.6
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN101864443A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 汲振余;康巧珍;郭歡;孫蕾;趙立群;楊觀瑞;閻紅霞;張亞冰;張聚真;楊小靜;裘一兵
• 申請（專利權）人: 河南省醫藥科學研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其是提供一種沉默食管癌細胞HIF-1α基因29shRNA表達載體的構建。

背景技術

人類超過一半的中晚期原位癌有缺氧區，氧濃度比周圍正常組織大大降低。例如，人類乳腺癌平均氧分壓為10mmHg，而正常乳腺組織為65mmHg。實體瘤內缺氧不僅因為腫瘤快速增殖，而且因為血管結構和功能異常使腫瘤得不到足夠的營養物和氧。缺氧會給細胞帶來嚴重的生存壓力，氧平衡需要一系列基因的協同調節。在多種類型細胞中，當氧含量降低時可調控轉錄復合體缺氧誘導因子1(HIF-1)的表達，HIF-1活性受細胞水平HIF-1α亞基調控，它與缺氧誘導因子-1β(HIF-1β)二聚化，形成活性轉錄因子。HIF-1在常氧細胞中很難檢測到，缺氧的條件下很快被激活，HIF-1活化后其靶基因表達上調，誘導多數編程性細胞保護反應，如抗缺氧、抗缺血或抗損傷，即誘導促紅細胞生成素、血管內皮生長因子和其它血管生成相關因子的基因表達，誘導糖代謝和葡萄糖轉運相關基因的表達，從而有助于改善細胞營養不良環境，據報道HIF-1可激活多達近百個靶基因。

食管癌中不僅存在HIF-1α的活化現象，且HIF-1α蛋白表達水平和病人存活時間呈負相關。對利用光動力學(Photodynamic?therapy，PDT)治療的食管早期癌臨床標本研究發現HIF-1α影響PDT療效。

RANi是自然界普遍存在的導致基因沉默的生物現象。1998年，Fire?A等首次提出了RNA干擾學說。其基本原理是siRNA與互補的mRNA結合形成沉默復合體，導致mRNA降解而使目的基因表達沉默。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發動的，該分子可以被Dicer?enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA，然后這種小的干擾RNA分子摻入RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced?silencing?complex，RISC)，引導核酸酶降解靶RNA，從而產生RNA干擾。這使得構建表達shRNA的干擾載體，從而使哺乳動物細胞內基因表達長期沉默成為可能。

發明內容

本發明的目的在于提供一種沉默食管癌細胞HIF-1α基因29shRNA表達載體的構建，為以HIF-1α為靶標的食管癌新藥開發和基因治療提供了新材料。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的沉默食管癌細胞HIF-1α基因29shRNA表達載體的構建，包括下述步驟：

(1)根據NCBI獲取NM_001530.3，設計正義鏈5’CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAG3’的29寡核苷酸干擾序列；

(2)以pENTR/H1/TO為載體，依據質粒的插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的單鏈DNA?oligos，在正義鏈序列5’加入鏈接序列CACCA，中部加入loop環(GAGA)結構，反義鏈5’端加AAAA連接序列，3’端加T；設計最終連接的編碼shRNA的DNA序列為正向：CACCA?CTACT?CAGGA?CACAG?ATTTA?GACTT?GGAGG?AGACT?CCAAGTCTAA?ATCTG?TGTCC?TGAGT?AG，反向：AAAAC?TACTC?AGGAC?ACAGA?TTTAG?ACTTG?GAGTCTCCTC?CAAGT?CTAAA?TCTGT?GTCCT?GAGTA?GT；

(3)單鏈DNA?oligos退火生成雙鏈oligos，雙鏈oligo連接pENTRTM/H1/TO載體，按照20μl反應體系進行連接反應，室溫孵育5min，冰浴并轉化感受態E.coli，用含50mg/l卡那霉素瓊脂平板篩選陽性克隆；擴大培養陽性菌并提取得到pENTRTM/H1/TOhif-1α的重組質粒。