[發明專利]沉默食管癌細胞HIF-1α基因29ShRNA表達載體的構建無效
| 申請號： | 201010178613.6 | 申請日： | 2010-05-21 |
| 公開（公告）號： | CN101864443A | 公開（公告）日： | 2010-10-20 |
| 發明（設計）人： | 汲振余;康巧珍;郭歡;孫蕾;趙立群;楊觀瑞;閻紅霞;張亞冰;張聚真;楊小靜;裘一兵 | 申請（專利權）人： | 河南省醫藥科學研究院 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/113 |
| 代理公司： | 鄭州異開專利事務所(普通合伙) 41114 | 代理人： | 王霞 |
| 地址： | 450000*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 沉默 食管 癌細胞 hif 基因 29 shrna 表達 載體 構建 | ||
1.一種沉默食管癌細胞HIF-1α基因29ShRNA表達載體的構建，其特征在于：包括下述步驟：
(1)根據NCBI獲取NM_001530.3，設計正義鏈5’CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAG3’的29寡核苷酸干擾序列；
(2)以pENTR/H1/TO為載體，依據質粒的插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的單鏈DNA?oligos，在正義鏈序列5’加入連接序列CACCA，中部加入loop環(GAGA)結構，反義鏈5’端加AAAA連接序列，3’端加T；設計最終連接的編碼shRNA的DNA序列為正向：CACCA?CTACT?CAGGA?CACAG?ATTTA?GACTT?GGAGG?AGACT?CCAAGTCTAA?ATCTG?TGTCC?TGAGT?AG，反向：AAAAC?TACTC?AGGAC?ACAGA?TTTAG?ACTTG?GAGTCTCCTC?CAAGT?CTAAA?TCTGT?GTCCT?GAGTA?GT；
(3)單鏈DNA?oligos退火生成雙鏈oligos，雙鏈oligo連接pENTRTM/H1/TO載體，按照20μl反應體系進行連接反應，室溫孵育5min，冰浴并轉化感受態E.coli，用含50mg/l卡那霉素瓊脂平板篩選陽性克?。粩U大培養陽性菌并提取得到pENTRTM/H1/TOhif-1α的重組質粒。
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