[發明專利]Delta1轉導的OP9細胞共培養體系的方法

無效

• 申請號: 201010178255.9
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN102250834A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 黃家學;侯士芳;王雪蓮;張宇光;孟恒星;陳曉波
• 申請（專利權）人: 協和干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/0775;C12N5/0789
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明涉及一種細胞共培養體系，尤其是一種簡單有效的體外T細胞定向分化的體系，即Delta1轉導的OP9細胞共培養體系的方法。

背景技術

人體對自身的病變細胞和病原體的清除由免疫系統來承擔。免疫系統的細胞成分主要由B細胞、T細胞及樹突狀細胞等抗原遞呈細胞來完成。T細胞分為細胞殺傷CD8T細胞和CD4助細胞。由于T細胞在自身免疫性疾病、病毒感染、腫瘤殺傷、細菌及真菌感染中的重要作用，T細胞及人工改造的抗原特異性細胞被用來治療腫瘤、對特定病毒缺乏免疫力的病原體感染和針對自身的過度免疫反應。體外人工誘導功能性T細胞并賦于其抗原特異性是治療自身免疫生疾病、久治不愈的感染性疾病的有效手段之一。

在一種簡單的單層基質細胞的作用下，能夠分化出T細胞的這種能力不僅有助于解決關于T細胞的產生需要分子間的相互作用的基礎性問題，而且提供一個研究T細胞發育的新系統。在發現OP9-DL1細胞之前，研究T細胞的發育需要FTOCs。這種FTOCs雖然有效，但是很復雜而且效率相當低。因此，需要發明一種新的簡單有效的體外T細胞分化體系。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，設計了一個操作簡便、效率高的OP9-DL1細胞體外共培養體系，體外獲得T細胞。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種Delta1轉導的OP9細胞共培養體系的方法，包括以下步驟：(1)OP9-DL1細胞失去支持HSCs發育成為B細胞的能力；(2)OP9-DL1獲得誘導HSCs發育成為T細胞的正常的程序。

具體地說，OP9-載體和小鼠Delta-like?1轉導OP9細胞基質細胞系保存在添加了20％牛血清的改良培養基中；干細胞因子Flt3-L和IL-7的濃度依照R&D使用說明添加，祖細胞接種到平板的前一天，每個孔板中的基質細胞數要達到2×10⁴；將祖細胞以不同的密度添加到不同孔板的基質細胞，確定產生最佳淋巴細胞的祖細胞添加濃度；培養一周后，用0.53m?MEDTA/PBS，pH7.4來收集基質細胞和造血細胞，然后，3000-10000的造血細胞與基質細胞共同轉接到新鮮的基質細胞進行傳代培養；經過幾周的分化觀察后，用基質細胞通過VCAM-1抗體染色的方法被去除，而死亡細胞則通過7-aminoactinomycinD染色被去除，當造血細胞的得率達到95％，此培養條件和細胞密度可取。

本發明的有益效果是：OP9-DL1細胞體外共培養體系，可以誘導許多不同來源的祖細胞發育成為T細胞。到目前為止，我們已經可以高效的誘導或者說支持分化為T細胞的干細胞有小鼠胚胎肝細胞來源的HSCs，從骨髓來源的HSCs，未分化的ESCs，骨髓來源的淋巴祖細胞，胸腺來源的祖細胞和人Cord血來源的HSCs。

具體實施方式

小鼠胚胎：嵌入RAG-1/GFP基因的雄性小鼠與C57BL/6雌性小鼠交配產生的RAG-1/GFP胚胎。

OP9共培養：OP9-載體和小鼠Delta-like?1轉導OP9細胞基質細胞系保存在添加了20％牛血清的改良培養基中。干細胞因子Flt3-L和IL-7的濃度依照R&D使用說明添加。祖細胞接種到平板的前一天，每個孔板中的基質細胞數要達到2×10⁴。然后，將祖細胞以不同的密度添加到不同孔板的基質細胞，目的是為了確定產生最佳淋巴細胞的祖細胞添加濃度。培養一周后，用0.53m?M?EDTA/PBS(pH7.4)來收集基質細胞和造血細胞。然后，3000-10000的造血細胞與基質細胞共同轉接到新鮮的基質細胞進行傳代培養。經過幾周的分化觀察后，用基質細胞通過VCAM-1抗體染色的方法被去除，而死亡細胞則通過7-aminoactinomycinD染色被去除。當造血細胞的得率達到95％則認為此培養條件和細胞密度可取。

細胞分選：骨髓陰性細胞的獲取和富集是通過與標記抗體的混合孵化，包括CD45RA，CD19，Gr-1，CD11b/Mac-1，Ter-119；然后通過MACS細胞分離系統分離陰性細胞部分。陽性細胞則被電子控出。

移植：移植前4小時，同類系LY5.1小鼠要經過單劑量960rad的照射。然后，10⁵受體骨髓細胞與10⁵Lin_c-Kit_Sca-1_分離細胞混合，注射到受體內。經過21-28天觀察細胞注射和分化情況，并觀察其致瘤性。

綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。