[發明專利]一種產油微生物RNA的提取方法

無效

• 申請號: 201010176579.9
• 申請日: 2010-05-19
• 公開（公告）號: CN102250875A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 唐偉;張素芳;譚海東
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及一種微生物RNA的提取方法，特別是涉及到產油微生物RNA的提取方法。

背景技術

自然界中部分微生物，如細菌、酵母菌、霉菌和藻類等，能在特定的培養條件下，在胞內貯存質量超過其細胞干重20％(w/w)的油脂，具有這種表型的微生物被稱為產油微生物。這些產油微生物所產的油脂主要以脂肪酸甘油三酯的形式存在，其組成與一般的動植物油脂相似。近年來微生物油脂發酵也逐漸成為生物柴油產業和工業生物技術的重要研究方向。相對于一般的微生物來說，產油微生物胞內油脂含量較高。如某些紅酵母屬的菌株能以糖質原料為碳源的培養基發酵，在胞內積累超過其細胞干重70％(w/w)的油脂(Li?YH，Zhao?ZB，Bai?FW.Enzyme?Microb?Technol，2007(41)：312-317)，而同時還大量合成色素。這些高含量的油脂與色素對RNA的分離純化會產生很大的干擾，嚴重影響提取RNA的質量和產量。而分離提取高質量的RNA是基因表達、調控與基因工程等研究的基礎。目前微生物RNA提取方法有很多，單獨采用Trizol試劑盒(Gilchrist?M，MacDonald?AJ，Neverova?I，et?al.J?Immunol?methods，1997(201)：207-214)、熱酸酚處理(Schmitt?ME，Brown，TA，Trumpower?LB.Nucleic?Acids?Res，1990(18)：3091-3092)、玻璃珠破碎細胞(奧斯伯F，金斯頓R，塞德曼J.精編分子生物學實驗指南.1998：597-598)和液氮研磨(Sayler?GS，Fleming?JT，Nivens?DE.Curr?Opin?Biotechnol.2001(12)：455-60)等方法均不能有效的從產油微生物中提取高質量的RNA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種經濟、簡單的操作方法，從產油微生物中提取高質量(高純度)的細胞總RNA。

為了實現上述目的，本發明所采用的操作步驟為：

一種從產油微生物中提取高質量RNA的方法，產油菌體首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取緩沖液中采用玻璃珠振蕩(相結合的方式)進行細胞破碎，得細胞破碎液；在細胞破碎液中加入有機溶劑去除油脂，離心后取水相，加入醋酸鈉、酸性苯酚、氯仿和異戊醇除去胞內蛋白，離心后取水相加入異丙醇沉淀RNA，洗滌沉淀，真空干燥后加入DEPC處理水溶解。

具體操作過程為，

1)取細胞密度為1×10⁷-1×10⁸細胞/ml的菌體經液氮速凍的產油菌體研磨破碎0.5-30min至粉末狀，刮取粉末裝于離心管中，加入RNA提取緩沖液，菌體與RNA提取緩沖液體積比例為10ml∶1-2ml；

2)向離心管中加入玻璃珠間歇振蕩，總的破碎時間為0.5-30min；每10ml菌體(5ml離心管中)加入0.5-1.5g玻璃珠；

3)向離心管中加入有機溶劑，充分混勻后0-4℃，12000-18000×g離心5-10min；有機溶劑的量為1/4-3/4RNA提取緩沖液體積；

4)取分層后的水相轉移至干凈的離心管中，加入濃度為3M、pH為4.6的醋酸鈉和體積比為25∶24∶1酸性苯酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻0-4℃，12000-18000×g離心5-15min；按10ml菌體計，加入100μl的醋酸鈉和1ml混合液；

5)取分層后的水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，置于0--70℃放置5min-16h，然后0-4℃，12000-18000×g離心5-15min獲得沉淀的RNA；

6)獲得的RNA沉淀用70％的乙醇洗滌干燥后加入體積比0.01％-0.5％的DEPC處理水溶解保存。

RNA提取緩沖液為內含4M異硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉、pH?7.0、0.5wt％巰基乙醇的水溶液。

所述的玻璃珠振蕩破碎方法為間歇振蕩，每次振蕩10s-10min后置于冰上冷卻0.5-10min，總的破碎時間為0.5-30min，玻璃珠直徑為0.2-1mm。

所述去除油脂的有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、石油醚或它們之間的任意比例混合。

本發明區別于傳統的微生物RNA提取方法，為了快速的破碎細胞，采用液氮研磨和玻璃珠振蕩相結合的方式。

本發明加入有機試劑，有效的去除了產油微生物胞內大量油脂及色素，減少了對RNA分離純化的干擾。