[發(fā)明專利]一種產(chǎn)油微生物RNA的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010176579.9
• 申請日: 2010-05-19
• 公開（公告）號: CN102250875A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 唐偉;張素芳;譚海東
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種從產(chǎn)油微生物中提取高質(zhì)量RNA的方法，其特征在于：

產(chǎn)油菌體首先采用液氮研磨成粉末、然后于RNA提取緩沖液中采用玻璃珠振蕩進(jìn)行細(xì)胞破碎，得細(xì)胞破碎液；在細(xì)胞破碎液中加入有機(jī)溶劑去除油脂，離心后取水相，加入醋酸鈉、酸性苯酚、氯仿和異戊醇除去胞內(nèi)蛋白，離心后取水相加入異丙醇沉淀RNA，洗滌沉淀，真空干燥后加入DEPC處理水溶解。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的產(chǎn)油微生物為產(chǎn)油真菌、產(chǎn)油細(xì)菌和/或產(chǎn)油微藻。

3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述產(chǎn)油真菌為Rhodosporidium?toruloides、Cryptococcus?curvatus、Yarrowia?lipolyica、Rhodotorula?glutinis、Rhizopus?arrhizus、Lipomyces?starkeyi、Mortierellaisabellina、Mucor?circinelloides、Cunninghamella中的一種或多種，產(chǎn)油細(xì)菌為Croynebacterium、Nocardia和Mycobacterium中的一種或多種；產(chǎn)油微藻為Botryococcus?braunii、Crypthecodinium?cohnii、Chlorellaprotothecoides、Nannochloropsis?sp.和Schizochytrium?limacinum中的一種或多種。

4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：具體操作過程為，

1)取細(xì)胞密度為1×10⁷-1×10⁸細(xì)胞/ml的菌體經(jīng)液氮速凍的產(chǎn)油菌體研磨破碎0.5-30min至粉末狀，刮取粉末裝于離心管中，加入RNA提取緩沖液，菌體與RNA提取緩沖液體積比例為10ml∶1-2ml；

2)向離心管中加入玻璃珠間歇振蕩，總的破碎時間為0.5-30min；每10ml菌體加入0.5-1.5g玻璃珠；

3)向離心管中加入有機(jī)溶劑，充分混勻后0-4℃，12000-18000×g離心5-10min；有機(jī)溶劑的量為1/4-3/4RNA提取緩沖液體積；

4)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入濃度為3M、pH為4.6的醋酸鈉和體積比為25∶24∶1酸性苯酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻0-4℃，12000-18000×g離心5-15min；按10ml菌體計，加入100μ1的醋酸鈉和1ml混合液；

5)取分層后的水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，置于0--70℃放置5min-16h，然后0-4℃，12000-18000×g離心5-15min獲得沉淀的RNA。

5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：獲得的RNA沉淀用70％的乙醇洗滌干燥后加入DEPC處理水溶解保存。

6.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于：RNA提取緩沖液為內(nèi)含4M異硫氰酸胍、0.5wt％十二烷基肌氨酸鈉、25mM檸檬酸鈉、pH7.0、0.5wt％巰基乙醇的水溶液。

7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征還在于：所述的玻璃珠振蕩破碎方法為間歇振蕩，每次振蕩10s-10min后置于冰上冷卻0.5-10min，總的破碎時間為0.5-30min，玻璃珠直徑為0.2-1mm。

8.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征還在于：所述去除油脂的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、石油醚或它們之間的任意比例混合。