[發明專利]重組火雞皰疹病毒細菌人工染色體轉移載體

無效

• 申請號: 201010176530.3
• 申請日: 2010-05-19
• 公開（公告）號: CN101864442A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 王永山;周宇;歐陽偉;范紅結
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/22
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及重組火雞皰疹病毒細菌人工染色體轉移載體，具體涉及轉移載體的分子設計、技術路線、轉移載體及其在研制重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面的應用，屬于生物制藥領域。

二、背景技術

火雞皰疹病毒(Herpesvirus?of?turkey，HVT)是一種無致病性的α皰疹病毒，最初于20世紀60年代末期從火雞體內分離得到，它屬于MDV-3型，基因組為線性、雙股DNA分子，大小約為160kb。HVT與雞的高度傳染性、致瘤性疾病馬立克氏病(MD)的病原馬立克氏病病毒(MDV)在遺傳學和血清學上具有相關性，因此，在70年代就開始作為預防MD的疫苗株在全球得到了廣泛的應用。另外，HVT作為病毒載體攜帶外源保護性抗原基因方面，與其它病毒載體相比具有許多優勢：使用安全，對雞及其它動物均無致病性；接種雞體后病毒在雞體內形成長達數周的病毒血癥，且終生潛伏感染，可刺激機體產生較高的抗體水平并維持終生，接種一次即可獲得終生免疫。目前，國外已成功地利用HVT作為載體表達了多種禽病原保護性抗原基因，包括新城疫病毒(NDV)、血清1型MDV、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等的保護性抗原，而且能抵抗致死劑量病原的感染，表明HVT是有效的基因工程疫苗活病毒載體。

由于HVT基因組龐大，結構復雜，而且具有很強的細胞結合性，在真核細胞中對其進行重組操作和研究，顯得困難重重。近年來，細菌人工染色體(BAC)技術在皰疹病毒上的應用解決了這一難題。通過構建HVT全基因組細菌人工染色體，就可以方便地利用Red/ET、Cre/loxP等現代基因重組系統對病毒進行反向遺傳操作。在大腸桿菌中就可以完成對HVT基因組的遺傳修飾，與在真核細胞中相比，該重組技術具有快速有效可靠的優點。

目前對于重組HVT的構建有兩種方法：一種是傳統的方法，即利用重組轉移載體與病毒基因組共轉染，將外源基因如lacZ基因等同源重組入病毒基因組中；另一種方法是利用BAC進行重組HVT的構建。使用傳統的方法即同源重組，由于受到CEF細胞的制備繁瑣、同源重組率低等因素的影響，使得重組HVT的構建較為困難，而利用BAC技術進行重組HVT的構建可以簡化繁瑣的病毒篩選過程。

三、發明內容

技術問題

本發明的目的在于，構建含有表達選擇標記黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉移酶基因(XGPRT，gpt)和細菌人工染色體(BAC)基本功能基因序列的重組HVT細菌人工染色體轉移載體pUAB-gpt-BAC，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性，可簡化重組病毒篩選過程，在研制重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面具有良好的應用前景。

技術方案

本發明根據大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉移酶基因(XGPRT，gpt)序列設計引物，以E.coli?DH5α染色體DNA為模板采用PCR方法擴增gpt基因，用其作為外源篩選基因，與質粒pEGFP中的CMV啟動子及poly(A)連接構建gpt表達盒Egpt(CMV-gpt-polyA)，經酶切測序鑒定后，插入到含有火雞皰疹病毒(HVT)非必需區US2兩側基因的同源臂克隆質粒pUAB中，構建帶有篩選基因表達盒的重組克隆質粒pUAB-gpt。將單拷貝細菌人工染色體(BAC)載體克隆到pUC18中，制備高拷貝BAC載體基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，獲得重組HVT細菌人工染色體轉移載體pUAB-gpt-BAC。包括：

1、重組火雞皰疹病毒(HVT)細菌人工染色體(BAC)轉移載體pUAB-gpt-BAC，大小為16100bp，HVT非必需區US2兩側同源臂A和B之間為8800bp含黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉移酶基因(XGPRT，gpt)基因表達盒Egpt的BAC-gpt核心序列，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性。

2、轉移載體pUAB-gpt-BAC，是通過分子設計構建的，具體包括：

第一步：根據HVT?Fc126株基因組序列(GenBank登錄號：AF291866)、gpt基因序列(GenBank登錄號：X00221.1)和質粒pEGFP-C1序列(GenBank登錄號：U55763.1)設計了以下PCR擴增引物。

第二步：以E.coli?DH5α染色體DNA為模板，用引物gpt-F、gpt-R擴增外源加壓篩選標記基因gpt，用pMD18-T克隆載體克隆，獲得含有gpt基因的陽性克隆質粒pMD-gpt；