[發(fā)明專利]重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010176530.3
• 申請(qǐng)日: 2010-05-19
• 公開（公告）號(hào): CN101864442A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王永山;周宇;歐陽(yáng)偉;范紅結(jié)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/22
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.重組火雞皰疹病毒HVT細(xì)菌人工染色體BAC轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，其大小為16?100bp，HVT非必需區(qū)US2兩側(cè)同源臂A和B之間為8800bp，含黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因XGPRT，簡(jiǎn)稱gpt基因，gpt基因表達(dá)盒Egpt的核心序列為BAC-gpt，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，是通過(guò)分子設(shè)計(jì)構(gòu)建的，具體包括：

第一步：根據(jù)GenBank登錄號(hào)：AF291866的HVT?Fc126株基因組序列、GenBank登錄號(hào)：X00221.1的gpt基因序列和GenBank登錄號(hào)：U55763.1的質(zhì)粒pEGFP-C1序列設(shè)計(jì)了以下PCR擴(kuò)增引物：

引物?????序列(5’-3’)????????????????????????????????酶切位點(diǎn)

gpt-F????GCGCTAGCGTCATGAGCGAAAAATACATCG???????????????Nhe?I

gpt-R????ACTGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGCG????????????????BamH?I

Egpt-F???GCGAATTCTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG??????EcoR?I

Egpt-R???GCGTCGACCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGA?????????Sal?I

A-F??????CGGGATCCACATCGGGCCACGTTCCGCC?????????????????BamH?I

?????????GCTCTAGAGCGTCGACCGGAATTCGATGAGCTGACGTGTGGA???XbaI、EcoR?I

A-R

?????????GGAATTCAAGTCGACGGAAGCTTCCACTAATATGGGCACAC????EcoR?I、Sal?I、HindIII

B-F

?????????GCTCTAGATGGCCCATCTAGGTGATTAT?????????????????Xba?I

B-R

第二步：以E.coli?DH5α染色體DNA為模板，用引物gpt-F、gpt-R擴(kuò)增外源加壓篩選標(biāo)記基因gpt，用pMD18-T克隆載體克隆，獲得含有g(shù)pt基因的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD-gpt；

第三步：用BamH?I與Nhe?I雙酶切pEGFP-C1質(zhì)粒，切除GFP基因，同時(shí)連接gpt片段，獲得含有g(shù)pt基因的表達(dá)質(zhì)粒pEgpt；然后，以pEgpt為模板，用引物Egpt-F、Egpt-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選標(biāo)記基因gpt的表達(dá)盒Egpt，即CMV-gpt-poly?A，與pMD18-T克隆載體連接，獲得含有g(shù)pt基因表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pMD-Egpt；

第四步：分別用引物A-F、A-R和B-F、B-R進(jìn)行PCR，以HVT感染細(xì)胞總DNA為模板，分別擴(kuò)增HVT左/右同源臂A/B，用pMD18-T載體克隆，分別獲得含有HVT同源臂A和B的克隆質(zhì)粒pMD-A和pMD-B；

第五步：將pMD-A用EcoR?I和Xba?I雙酶切，pMD-B用EcoR?I、Sca?I和Xba?I三酶切，回收pMD-A載體片段和同源臂B片段，T4?DNA連接酶連接，獲得含有HVT左/右同源臂A/B的克隆質(zhì)粒pUAB；

第六步：用EcoR?I和Sal?I分別雙酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表達(dá)盒Egpt和pUAB載體片段，T4DNA連接酶連接，獲得含有篩選標(biāo)記基因gpt表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pUAB-gpt；

第七步：用單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5構(gòu)建高拷貝BAC載體克隆質(zhì)粒pUC18-BAC：

提取pUC18質(zhì)粒，Hind?III單酶切，回收pUC18目的片段，與BAC載體pIndigoBAC-5連接，電轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B，加入37℃的SOC培養(yǎng)基，并將其轉(zhuǎn)移到1.5mL無(wú)菌Eppendorf管中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)1h，4000r/min離心5min，將細(xì)菌沉淀涂布于含氯霉素34μg/mL和氨芐青霉素100μg/mL的雙抗LB培養(yǎng)基平板上，挑取克隆，搖菌16h后提取質(zhì)粒，獲得高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC，其中SOC培養(yǎng)基為L(zhǎng)B中含有0.2mmol/L葡萄糖，0.1mmol/L?MgSO4和0.1mmol/L?MgCl₂；

第八步：將pUC18-BAC與pUAB-gpt分別用Hind?III酶切，回收pUAB-gpt線性化片段和BAC載體的基本功能基因，T4DNA連接酶連接，獲得重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體HVT-BAC轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC。

3.權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC在制備重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面的應(yīng)用。