[發明專利]一株丙酮丁醇梭桿菌菌株及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201010176444.2
• 申請日: 2010-05-18
• 公開（公告）號: CN101864389A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 何冰芳;歐陽平凱;姜岷;靳孝慶;吳斌;柏中中
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 樊文紅

技術領域

本發明涉及一株通過離子束誘變選育得到的高溶劑產量和高丁醇比的丙酮丁醇梭桿菌菌株，以及該菌株的篩選方法和其在溶劑發酵工業中的應用，屬于生物發酵技術領域。

背景技術

丁醇是重要的有機化工原料，廣泛應用于油漆、表面涂料、皮革處理、塑料等領域。作為燃料，丁醇具有能量密度大，對水的穩定性高、可直接用于內燃機、運輸方便等優點，在能源危機日益嚴峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發展前景。2005年我國丁醇表觀消費量已達到68萬噸，預計2010年國內丁醇需求量將達到97.2萬噸。由于國內產量不能夠滿足需要，我國已經是世界上最大的丁醇進口國。

丁醇的生產方法主要有乙醛縮合法，丙烯羰基合成法和發酵法。乙醛縮合法工藝流程長，收率低，成本較高，目前在國外已被淘汰；丙烯羰基合成法生產丁醇的原料為石化下游產品丙烯；隨著石油價格飛漲和資源加速枯竭，發酵法生產丁醇受到了廣泛的重視，逐漸成為生物能源的研究熱點之一。

近年來，國內對丙酮丁醇發酵的研究很多，主要圍繞著菌種誘變選育、基因工程改造、發酵工藝條件優化和溶劑提取等發面進行。山西大學顏敘秀(山西食品工業.1995，2：26～28)采用紫外誘變處理，篩選到代謝產物提高、穩定性好的菌種，總溶劑比出發菌提高約36％；中國專利申請ZL95111733.5報道了通過化學誘變處理丙酮丁醇梭桿菌，利用玉米粉或高粱為底物，發酵得到總溶劑產量在20g/L左右，丁醇比為70％的穩定菌株；Mermelstein等(Biotechnology?and?Bioengineering.1993，42：1053～1060)構建了含有乙酰乙酸脫羧酶、CoA轉移酶A、CoA轉移酶的質粒pFNK6，轉化Clostridiumnacetobutylicum?ATCC?824后，丙酮、丁醇和乙醇產量分別提高了95％、37％和90％；Kim等(Applied?Environment?Microbiology.1994，60：337～340)將Clostridium?cellulorans的內切葡聚糖酶基因eng?B導入Clostridium?beijerinckii中，其內切葡聚糖酶活力比原始菌種提高了4倍，這對丙酮、丁醇發酵中纖維素的利用具有重要意義；Tomas等(AppliedEnvironment?Microbiology.2003，69：4951～4965)將groESL操縱子基因在Clostridiumacetobutylicum?ATCC?824中過量表達，溶劑產量比野生型高40％。

可見，菌種改良是提高丙酮-丁醇發酵經濟競爭力的關鍵手段之一，而建立針對誘變菌種高效準確的篩選條件是獲得優良丙酮丁醇梭桿菌的重要環節之一。目前國內外僅有2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選丙酮-丁醇產生菌的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一在于培育具有新的性能的丙酮丁醇菌株，使其夠高效利用木糖和淀粉，且發酵的溶劑產量和丁醇比高；本發明要解決的技術問題之二在于提供所述丙酮丁醇菌株的新篩選方法；本發明要解決的技術問題之三在于提供所述丙酮丁醇菌株的用途。

為了解決本發明的技術問題，本發明的技術方案在于：

一、本發明培育了一株新的丙酮丁醇梭桿菌菌株，其分類命名為丙酮丁醇梭桿菌Clostridium?acetobutylicum?XY16，保藏號登記號為：CCTCC?NO：M?2010011。

二、本發明所述的丙酮丁醇梭桿菌Clostridium?acetobutylicum?XY16的篩選方法，其特征在于將丙酮丁醇梭桿菌出發菌株離子束誘變后，利用木糖平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選得到能夠高效利用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚綠平板、刃天青平板篩選得到產酸能力和還原力強的菌株，最后經搖瓶發酵篩選獲得總溶劑產量和丁醇比高的丙酮丁醇梭桿菌目標菌株。

其具體步驟如下：

a)離子束誘變：將丙酮丁醇梭桿菌原始菌株活化培養，培養溫度30～40℃，250mL搖瓶裝液量100～150mL，石蠟液封2～5cm，培養時間12～18h，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液，將培養的細胞稀釋5～10倍，涂布于滅菌的空培養皿中，用無菌空氣吹干；以5～15KeV作為離子注入的能量，以1.0～2.0×10¹⁶ions/cm²作為誘變劑量對菌株進行離子束誘變；