[發明專利]一株丙酮丁醇梭桿菌菌株及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201010176444.2
• 申請日: 2010-05-18
• 公開（公告）號: CN101864389A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 何冰芳;歐陽平凱;姜岷;靳孝慶;吳斌;柏中中
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12N15/01;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 樊文紅

1.一株丙酮丁醇梭桿菌菌株，其分類命名為Clostridium?acetobutylicum?XY16，其保藏號登記號為：CCTCC?NO：M?2010011。

2.根據權利要求1所述的丙酮丁醇梭桿菌菌株的篩選方法，其特征在于將丙酮丁醇梭桿菌出發菌株離子束誘變后，利用木糖平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選得到能夠高效利用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚綠平板、刃天青平板篩選得到產酸能力和還原力強的菌株，最后經搖瓶發酵篩選獲得總溶劑產量和丁醇比高的丙酮丁醇梭桿菌目標菌株。

3.根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，具體的篩選步驟如下：

a)離子束誘變：將丙酮丁醇梭桿菌原始菌株活化培養，培養溫度30～40℃，250mL搖瓶裝液量100～150mL，石蠟液封2～5cm，培養時間12～18h，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液，將培養的細胞稀釋5～10倍，涂布于滅菌的空培養皿中，用無菌空氣吹干；以5～15KeV作為離子注入的能量，以1.0～2.0×10¹⁶ions/cm²作為誘變劑量對菌株進行離子束誘變；

b)木糖平板篩選：菌株經離子誘變后，用生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度涂布于以0.5～2％的木糖作為唯一碳源的平板上，在30～40℃溫度下厭氧培養24～72h，挑選出在該平板上能夠生長的菌落；

c)2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選：將步驟b)篩選出的突變株點植于含有0.05～0.2％的2-脫氧-D-葡萄糖的常規固體培養基平板上進行篩選，在30～40℃溫度下厭氧培養12～36h，挑選生長情況顯著好于出發菌的菌落；

d)溴甲酚綠平板篩選：將步驟c)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30～40℃厭氧培養12～36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0.001％～0.01％的溴甲酚綠的常規固體培養基平板的孔洞中，在30～40℃溫度下厭氧培養12～36h，挑選出變色圈明顯大于出發菌的菌落；

e)刃天青平板篩選：將步驟d)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30～40℃厭氧培養12～36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0.001％～0.01％的刃天青平的常規固體培養基平板的孔洞中，在30～40℃溫度下厭氧培養12～36h，挑選出變色圈明顯大于出發菌的菌落；

f)搖瓶發酵篩選：將步驟e)篩出的菌落接入種子培養基擴大培養，培養溫度30～40℃，厭氧培養培養時間12～36h，然后在發酵培養基中發酵，接種量5％～15％(v/v)，發酵溫度30～40℃，厭氧發酵發酵時間30～60h；考察步驟d)和e)篩選出的菌落發酵產總溶劑的量和溶劑中的丁醇比，同時選出總溶劑產量和丁醇比最高的菌落。

4.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于所述的步驟a)中離子誘變采用10KeV作為離子注入的能量，1.6×10¹⁶ions/cm²作為誘變劑量。

5.根據權利要求1所述的丙酮丁醇梭桿菌菌株在發酵生產丁醇中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的具體應用步驟如下：

1)平板培養：將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium?acetobutylicum?XY16接種至平板培養基厭氧培養，培養溫度30～40℃，培養時間12～36h；

2)種子培養：將平板培養的丙酮丁醇梭桿菌Clostridium?acetobutylicum?XY16接種到種子培養基中，培養溫度30～40℃，250mL搖瓶裝液量100～150mL，石蠟液封1～3cm，培養時間12～36h；

3)發酵產丁醇：將種子培養液熱激1～5min，接種到發酵培養基中，接種量5％～15％(v/v)，發酵溫度30～40℃，發酵培養時間為36～80h。

7.一種權利要求1所述的丙酮丁醇菌株在生產丁醇中的應用，其特征在于：利用丙酮丁醇菌株XY16發酵，總溶劑產量達到16～23g/L，丁醇比達到了64～75％。