[發明專利]假交替單胞菌、所產的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應用

無效

• 申請號: 201010175433.2
• 申請日: 2010-05-18
• 公開（公告）號: CN101864388A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 趙肖為
• 申請（專利權）人: 溫州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/24;C12P19/14;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 黃挺

技術領域

本發明涉及一種假交替單胞菌、所產的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應用，屬于微生物應用技術領域。

背景技術

海藻寡糖硫酸酯具有抗病毒、抗發炎、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等多種生物和生理功能，其功能決定于結構特征，譬如糖單元結構、分子量、硫酸酯化程度和硫酸酯化位置等(Liu?J?M，et?al.Anticancer?Res，2000，20：3265-3271)。

卡拉膠(又稱角叉菜膠、鹿角菜膠)是許多海洋紅藻細胞壁的主要組分，這類含有硫酸酯基團的線性多糖由交叉連接的(1→3)-β-D-半乳吡喃糖與(1→4)-α-D-半乳吡喃糖(或3，6-脫水-α-D-半乳吡喃糖)構成其骨架結構。商業上應用廣泛的主要是κ-卡拉膠、ι-卡拉膠和λ-卡拉膠，它們在每個二糖單元上分別有1、2和3個硫酸酯。因此，卡拉膠的降解產物引起人們廣泛的興趣(MouH，et?al.J?Appl?Phycol，2003，15：297-303)。現行的酸法水解條件過于強烈，往往造成卡拉膠易變但富有價值的骨架結構遭受破壞(Barbeyron?T，et?al.Mol?BiolEvol，1998，15：528-537)。酶法水解很受期待(Knutsen?S?H，et?al.Carbohydr?Ploym，1992，19：199-210)，并且已經從噬纖維菌(Cytophaga，Potin?P，et?al.Eur?J?Biochem，1991，201：241-247)、假單胞菌(Pseudomonas，K，et?al.Enzyme?MicrobTechnol，1993，15：326-333)、弧菌(Vibrio，Araki?T，et?al.Fish?Sci，1999，65：937-942)、交替單胞菌(Alteromonas，Michel?G，et?al.Acta?Crystallogr?D，2000，56：766-768)和假交替單胞菌(Pseudoalteromonas，Michel?G，et?al.Structure，2001，9：513-525)等海洋細菌中分離得到卡拉膠水解酶。但是，其應用因卡拉膠水解酶生產率過低而受到很大的限制(Dyrset?N，et?al.Enzyme?Microb?Technol，1997，20：418-423)。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種假交替單胞菌所產的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應用。

本發明提供的假交替單胞菌WZU4771菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.3407。

上述的假交替單胞菌菌株用于發酵得到κ-卡拉膠水解酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)發酵：將所述假交替單胞菌WZU4771接入含κ-卡拉膠的培養基中，溫度20～35℃，優選25℃，培養24～48h，離心，取上清液。

2)分離：0～4℃下，將步驟1)所述上清液經(NH₄)₂SO₄鹽析和DEAE-纖維素層析，冷凍干燥后，得到所述的κ-卡拉膠水解酶。具體步驟為：(1)向所述上清液中加入固體(NH₄)₂SO₄至56％的飽和度，攪拌，離心，得上清液II，向上清液II中加入固體(NH₄)₂SO₄至65％的飽和度，攪拌，離心，收集沉淀物；(2)將步驟1)所述沉淀物溶于濃度為0.05mM、pH?7.1的Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液中還含有0.01M的2-巰基乙醇，在相同的緩沖溶液中透析后，裝載到DEAE-纖維素DE52層析柱上，用濃度為0.1M的KCl溶液洗脫，收集具有κ-卡拉膠水解酶活性的餾分；(3)向步驟(2)所述的餾分中加入固體(NH₄)₂SO₄至65％的飽和度，攪拌，離心，收集沉淀物，將沉淀物溶于濃度為0.05mM、pH?7.1的Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液中還含有0.01M的2-巰基乙醇，在相同的緩沖溶液中透析，冷凍干燥，得到κ-卡拉膠水解酶。

作為優選，步驟1)將假交替單胞菌WZU4771以占含κ-卡拉膠的培養基體積3％～10％的接種量接入含κ-卡拉膠的培養基中。