[發明專利]假交替單胞菌、所產的κ-卡拉膠水解酶及其制備和應用

無效

• 申請號: 201010175433.2
• 申請日: 2010-05-18
• 公開（公告）號: CN101864388A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 趙肖為
• 申請（專利權）人: 溫州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/24;C12P19/14;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 黃挺

1.一株假交替單胞菌，其特征在于，所述菌株為假交替單胞菌WZU4771，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.3407。

2.權利要求1所述的假交替單胞菌得到κ-卡拉膠水解酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)發酵：將所述假交替單胞菌WZU4771接入含κ-卡拉膠的培養基中，溫度20～35℃下，培養24～48h，離心，取上清液；

2)分離：0～4℃下，將步驟1)所述上清液經(NH₄)₂SO₄鹽析和DEAE-纖維素層析，冷凍干燥，得到所述的κ-卡拉膠水解酶。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)將假交替單胞菌WZU4771以占所述含κ-卡拉膠的培養基體積3％～10％的接種量接入所述培養基中。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述培養基為含質量濃度6％～10％碳源、0.3％～0.7％氮源、0.3％κ-卡拉膠和1.5％NaCl的水溶液。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源為葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種，所述氮源為玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨或硝酸鈉中的一種。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源為葡萄糖，所述氮源為玉米漿。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述溫度為25℃。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述上清液經(NH₄)₂SO₄鹽析和DEAE-纖維素層析的具體步驟為：

(1)向所述上清液中加入固體(NH₄)₂SO₄至56％的飽和度，攪拌，離心，得上清液II，向上清液II中加入固體(NH₄)₂SO₄至65％的飽和度，攪拌，離心，收集沉淀物；

(2)將步驟(1)所述沉淀物溶于濃度為0.05mM、pH?7.1的Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液中還含有0.01M的2-巰基乙醇，在相同的緩沖溶液中透析后，裝載到DEAE-纖維素DE52層析柱上，用濃度為0.1M的KCl溶液洗脫，收集具有κ-卡拉膠水解酶活性的餾分；

(3)向步驟(2)所述的餾分中加入固體(NH₄)₂SO₄至65％的飽和度，攪拌，離心，收集沉淀物，將沉淀物溶于濃度為0.05mM、pH?7.1的Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液中還含有0.01M的2-巰基乙醇，在相同的緩沖溶液中透析，冷凍干燥，得到κ-卡拉膠水解酶。

9.根據權利要求2～8中任一項所述方法得到的κ-卡拉膠水解酶，其特征在于，所述κ-卡拉膠水解酶的分子量為45000，能夠水解κ-卡拉膠中的β-(1→3)-鍵，最終得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。

10.權利要求9所述的κ-卡拉膠水解酶用于制備κ-新卡拉四糖硫酸酯的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)向κ-卡拉膠水溶液中加入所述的κ-卡拉膠水解酶，混合液經攪拌，離心去除不溶物，真空蒸發，冷凍干燥，得凍干粉；

2)將步驟1)所述凍干粉溶解于乙醇水溶液中，離心去除不溶物，取上清液，蒸發去除乙醇后，用蒸餾水稀釋，然后裝載到聚丙烯胺凝膠Bio-Gel?P-6DG層析柱上，以濃度為0.1M的NaNO₃水溶液洗脫，收集含κ-新卡拉四糖硫酸酯的餾分，在蒸餾水中透析，真空蒸發，冷凍干燥，得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。