[發明專利]海洋甲殼類動物支原體培養基及分離純化方法

有效

• 申請號: 201010175031.2
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101864387A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 楊季芳;陳吉剛;樓丹
• 申請（專利權）人: 楊季芳
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平

技術領域

本發明涉及到一種支原體培養基及分離純化方法。

背景技術

現有的支原體屬于原核細胞生物，是目前能在無活性細胞培養基中獨立生存、自我繁殖的最小微生物，無細胞壁結構，有高度的多形性，可透過微孔濾膜。支原體除了能引起人類傳染病外，還能引起家畜、家禽和作物病害(Razin?S.Peculiar?properties?ofmycoplasmas：the?smallest?self-replicating?prokaryotes.FEMS?Microbiol?Lett，1992，79(1-3)：423-431.)。自1937年分離出第一株人系支原體以來，迄今已有120余種支原體被陸續報道，且多見于哺乳動物和節支動物昆蟲綱種類(Razin?S.Yogev?D.Naot?Y.Molecular?biology?and?pathogenicity?of?mycoplasmas.Microbiol?Mol?Biol?Rev.1998，62(4)：1094-1156.)。然而有關甲殼綱的支原體，目前國內外均極少報道。楊季芳等(楊季芳，中國對蝦枝原體超微結構及宿主的主要超微病理變化，海洋與湖沼，1997，Vol.28，No.2；楊季芳，中國對蝦流行性肝胰腺壞死綜合癥研究I病毒和類枝原體合并感染對蝦肝胰腺，1993，東海海洋，Vol?11，NO3，34-39.)從養殖中國對蝦腸道結節病和白斑綜合癥中發現支原體與細菌及支原體與白斑綜合癥病毒的混合感染。無致病性支原體在環境中大量存在并在健康動物體內長期存在，攜帶支原體的動物在沒有受到應激脅迫之前并不會表現任何癥狀。然而，從患病死亡的對蝦眼、鰓、腦中分離的支原體純培養物能夠使健康對蝦發病，或使健康動物更容易受到病毒和細菌的感染(Ghadersohi?A，Leigh?O.Isolation，charactersation?and?DNA?analysis?of?Mycoplasma?spp.from?moribund?prawnsPenaeus?monodon?cultured?in?Austualia.Dis?Aquat?Org，1999，35：53-61)。

對甲殼動物支原體進行科學研究，首要要解決的瓶頸問題是制備適合甲殼動物支原體體外生長繁殖的培養基。目前用于人類及畜禽支原體培養的培養基均不能滿足甲殼動物支原體的生長需求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種海洋甲殼類動物支原體培養基。

本發明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種海洋甲殼類動物支原體培養基分離純化方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該海洋甲殼類動物支原體培養基，包括液體培養基和固體培養基，其特征在于：

將

支原體肉湯培養基????????12.0～15.0g

0.4-1wt％苯酚紅??????????2.35～3.00mL

重蒸水??????????????????470～600mL

在pH為7.0-8.0、110℃-121℃的條件下滅菌10-20min后，加入5-30mL小牛血清在56℃滅活30min，然后再加入10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均勻得到所述的液體培養基；

將

支原體肉湯培養基????????12.0～15.0g

重蒸水??????????????????470～600mL

瓊脂粉??????????????????0.94～1.2wt％

在pH7.0-8.0、110℃-121℃條件下滅菌10-20min，待冷卻至55～60℃后，加入已過濾除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均勻后將混合液傾注到滅菌平板上制成固體培養基；上述瓊脂粉的用量為每100mL固體培養基加入0.94-1.2g。

其中，所述新鮮酵母浸出液的制備方法如下：