[發明專利]海洋甲殼類動物支原體培養基及分離純化方法

有效

• 申請號: 201010175031.2
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101864387A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 楊季芳;陳吉剛;樓丹
• 申請（專利權）人: 楊季芳
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平

1.一種海洋甲殼類動物支原體培養基，包括液體培養基和固體培養基，其特征在于：

將

支原體肉湯培養基??????12.0～15.0g

0.4-1wt％苯酚紅???????2.35～3.00mL

重蒸水????????????????470～600mL

在pH為7.0-8.0、110℃-121℃的條件下滅菌10-20min，冷卻至50-60℃后加入5-30mL小牛血清在56℃滅活30min，然后再加入10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-10wt％葡萄糖溶液0.5-3mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-20mg/mL青霉素0.5-2mL混合均勻得到所述的液體培養基；

將

支原體肉湯培養基????12.0～15.0g

重蒸水??????????????470～600mL

瓊脂粉??????????????0.94～1.2wt％

在pH7.0-8.0、110℃-121℃條件下滅菌10-20min，待冷卻至55～60℃后，加入已過濾除菌的小牛血清5-30mL、10-40v％新鮮酵母浸出液5-20mL、5-15wt％醋酸鉈水溶液0.1-0.5mL和5-15mg/mL青霉素0.5-2mL，混合均勻后將混合液傾注到滅菌平板上制成固體培養基；

其中，所述新鮮酵母浸出液的制備方法如下：

稱取高活性干活酵母，懸浮于2-6倍的蒸餾水中，在20-40℃攪拌5-30min后，在室溫下發酵15-60min，然后加熱至沸點，冷卻得到發酵液；將發酵液以2000-4000rpm離心15-30min，取上清液，用NaOH調pH值至7.0～8.0，然后將上清液置于90～95℃水浴中10-20min；冷卻后，再以7000～8000rpm離心15-30min，取上清液用0.22-0.45μm膜過濾除菌即得到新鮮的酵母浸出液。

2.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟：

1)無菌剪取病樣器官，加3～6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養基及0.5-1倍病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經0.22-0.45μm膜無菌過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；

2)取無菌上清液接種于10倍體積所述的液體培養基中，置于22-41℃、濃度為5％～10v％的二氧化碳培養箱中培養，48-72h盲傳，將盲傳代接種到所述的固體培養基上，置于22-41℃、濃度為5％～10v％的二氧化碳培養箱中培養，進行菌落生長，得到特征菌落；

3)將所述的特征菌落再接種到所述的液體培養基上培養生長，將得到的培養物接種到所述固體培養基上進行菌落生長；重復該步驟，直至得到所需支原體的特征菌落；

4)用無菌刀片挑取所述的特征菌落接種于所述的液體培養基，于22-41℃、50-100rpm震蕩培養，至液體培養基顏色由紅變黃時取出培養物；對該培養物與所述液體培養基進行10倍稀釋法，稀釋至所需濃度，得到稀釋液；取0.1-1mL上述稀釋液接種于固體培養基繼續培養，分離出支原體特征病菌；

5)重復步驟4三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。

3.一種海洋甲殼類動物支原體的分離純化方法，其特征在于包括下述步驟：

1)無菌剪取病樣器官，加3～6倍病樣器官體積的支原體肉湯培養基及0.5-1倍病樣器官體積的石英砂，無菌研磨成乳劑，3000-5000rpm離心10-20min，將上清液經0.22-0.45μm無菌濾器過濾，除去雜菌，得到無菌上清液；

2)取0.2-1mL無菌上清液涂布于所述的固體培養基上，22-41℃下置于二氧化碳培養箱的潮濕環境中培養，CO₂濃度范圍為5％～10v％，培養3～5天，得到支原體特征菌落；用無菌刀片選取所述的特征菌落接種于液體培養基，在22-41℃、50-100rpm條件下震蕩培養，至液體培養基的顏色變黃時得到培養物；向該培養物中加入所述的液體培養基進行10倍稀釋法，得到所需濃度的稀釋液；將該稀釋液接種至所述固體培養基繼續培養，分離出支原體特征菌落；

3)對得到的特征菌落重復步驟2三次以上，得到純化的海洋甲殼類支原體。