[發明專利]水稻花粉母細胞特異性表達基因

無效

• 申請號: 201010174874.0
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN102242113A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發明（設計）人: 唐威華;張棟;湯湘;趙仕蘭
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/29;C12N15/113;C12N5/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及水稻花粉母細胞特異性表達基因。

背景技術

減數分裂是所有真核生物有性生殖過程中的關鍵。所有真核生物的減數分裂過程是高度保守的。減數分裂與有絲分裂的不同在于，一輪DNA復制后它經過了兩次連續的細胞分裂。減數分裂I時期的染色體行為，如同源染色體排列、聯會、重組和交叉釋放，是減數分裂所特有的，并且是進行遺傳特性分類的基礎。在酵母中，對于減數分裂的研究是廣泛的，但是在植物中，對于減數分裂一系列事件的遺傳控制的研究還是有限的。完全的減數分裂的特異性基因列表對于全面了解植物的減數分裂機制是非常有用的。

有性生殖發育中的最關鍵點是在從有絲分裂細胞周期向減數分裂細胞周期的過渡中，所有的準備在減數分裂開始前完成。對于酵母、小鼠和玉米的研究指出控制減數分裂起始的信號級聯通路存在顯著的物種多樣性，但相比之下，減數分裂的基本過程在進化上是保守的。芽殖酵母中，減數分裂特異轉錄因子IME1通過正調節一個蛋白激酶編碼基因的表達開始其減數分裂過程。裂殖酵母中，一個RNA結合蛋白Mei2成為了減數分裂起始的開關。在小鼠的生殖細胞中，一個脊椎動物特有基因Stra8的特異性誘導對于向減數分裂過渡是必須的。而在玉米中，一個含有卷曲螺旋結構的植物特有蛋白Am1對于減數分裂的起始是必須的。因此研究水稻這種重要經濟作物的減數分裂起始的控制有重要的意義。

此外，基于基因對基因的研究手段，許多單獨的減數分裂相關基因的成功鑒定之后，更加全面的工具的應用，如芯片，以及遺傳學的和生物化學的路徑的整合，將揭示新的在遺傳學上控制減數分裂的基因的相互作用和路徑。

在植物中，只有花粉母細胞和大孢子母細胞通過減數分裂，由原來的二倍體細胞形成單倍體細胞，而所有其他細胞的分裂是通過有絲分裂實現的。相較于有絲分裂周期的細胞，花粉母細胞的轉錄組更全面地提供了減數分裂時期的特異基因，同時也提示了與減數分裂起始相關的路徑。

然而，由于花粉母細胞埋在雄蕊頂部的花藥之內，收集均一的花粉母細胞群落在技術上存在困難。例如，有研究描述了處于發育第五階段的水稻雄蕊富含花粉母細胞(Lu?XC，Gong?HQ，Huang?ML，Bai?SL，He?YB，Mao?X，Geng?Z，Li?SG，Wei?L，Yuwen?JS，Xu?ZH，Bai?SN(2006)Molecular?analysis?of?early?ricestamen?development?using?organ-specific?gene?expression?profiling.Plant?Mol?Biol61：845-851)，他們不得不切取整個處于發育第五階段的水稻雄蕊進行芯片分析。

因此，本領域有必要找到有效的收集均一的花粉母細胞群落的方法，從而更有利于花粉母細胞的深入分析。

發明內容

本發明的目的在于提供篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法。

本發明的另一目的在于提供水稻花粉母細胞特異性表達基因。

在本發明的第一方面，提供一種篩選水稻花粉母細胞特異性表達基因的方法，所述方法包括：

(1)利用激光捕獲顯微切割從水稻未成熟花序的切片(較佳地為石蠟切片)中分離出花粉母細胞；

(2)對花粉母細胞進行表達譜分析，并與處于有絲分裂時期的三核花粉和/或幼苗的表達譜進行比較，找出特異性在花粉母細胞中表達而不在三核花粉和/或幼苗中表達的基因，所述基因即是水稻花粉母細胞特異性表達基因。

在一個優選例中，所述的水稻未成熟花序是水稻發育時期第5期的未成熟花序。

在另一優選例中，水稻未成熟花序的切片如下制備：將水稻未成熟花序進行固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、干燥，得到用于分離水稻母細胞的水稻未成熟花序的切片。

較佳地，采用微波輔助的丙酮固定法進行固定。

較佳地，所述的切片的厚度為8-10μm。

較佳地，如下制備：將水稻未成熟花序經過微波輔助的丙酮法固定、石蠟滲透與包埋以及切片脫蠟，制成幼嫩花藥橫切片。

在另一優選例中，步驟(1)包括：在水稻未成熟花序的切片中將花粉母細胞標記出來，用紫外激光束將花粉母細胞與周圍細胞分開，收集花粉母細胞。

在另一優選例中，包括：