[發明專利]蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201010173609.0
• 申請日: 2010-05-17
• 公開（公告）號: CN102253202A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 李鋒;陳立柱
• 申請（專利權）人: 北京庫爾科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明是涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測蘇云金芽孢桿菌的檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)于1901年在日本被發現，1911年由柏林納從地中海粉螟的患病幼蟲中分離出來，并依其發現地點德國蘇云金省而命名。蘇云金芽孢桿菌簡稱蘇云金桿菌，為革蘭氏陽性土壤桿菌，屬于芽孢桿菌屬，其菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。它在芽孢形成過程中產生稱為δ-內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質的基因在質粒上)，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。

本發明采用膠體金免疫層析技術，制備一種快速檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑盒。這種方法開始于上個世紀90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎上發展起來的，是免疫親和技術、印刷技術、免疫標記技術和層析技術的結合。這種方法不僅具有敏感、特異、便捷、快速等特點，而且適合基層和現場使用。

發明內容

本發明的目的是提供一種方便、快捷地檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑盒，用于檢測樣本中的蘇云金芽孢桿菌。本試劑盒的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結合，用膠體金標記抗體，與待檢抗原結合后，與包被在硝酸纖維素膜上的抗體結合形成夾心物而顯色。本發明還涉及制備上述檢測試劑盒的方法。

本發明的技術方案：一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒，由樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)組成，PVC支撐板上依次粘貼樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，膠體金墊上包被了蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有蘇云金芽孢桿菌多抗和羊抗鼠IgG抗體，其中以蘇云金芽孢桿菌多抗包被線作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG抗體包被線作為質控線(C線)。

本發明還提供了一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備膠體金顆粒

取0.01％的氯金酸水溶液100mL，加熱煮沸。根據需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液0.75mL，繼續煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。

(2)制備膠體金墊

取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0.1mol/L?K₂CO₃將膠體金溶液的pH值調至9.0，室溫放置10分鐘；逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/ml的蘇云金芽孢桿菌多抗0.04ml，混合均勻，室溫放置30分鐘；加入0.075ml?10％牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；11000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，用含5％蔗糖的0.002mol/L?pH?9.0的硼酸鹽緩沖液5mL復溶，重復2次；最后用硼酸鹽緩沖液溶解至3mL，得到蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物；將蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物按1mL鋪56cm²的比例均勻鋪在無紡布上，再置干燥間，在溫度38℃，濕度小于30％的條件下干燥2-4小時，制成膠體金墊。

(3)包被蘇云金芽孢桿菌多抗、羊抗鼠IgG

設定劃膜儀涂覆參數1μL/cm，分別用微量進樣器取0.2mL蘇云金芽孢桿菌多抗、羊抗鼠IgG，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆蘇云金芽孢桿菌多抗(T線)、羊抗鼠IgG(C線)。劃線后將硝酸纖維素膜放置在烘箱中，溫度38℃，干燥24小時，備用。

(4)試劑盒的組裝

將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊由一端依次黏附在PVC支撐板上，即可形成檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑條，試劑條也可以裝入塑料卡中形成卡型包裝。

本發明采用層析式雙抗體夾心法，運用樣品中含有的蘇云金芽孢桿菌與金標蘇云金芽孢桿菌多抗結合，然后在毛細管作用下層析至檢測區，與事先包被在檢測區的蘇云金芽孢桿菌多抗反應，形成夾心物而顯色的原理檢測蘇云金芽孢桿菌。

本發明所述試劑盒的檢測方法為：將被檢樣品平衡至室溫；取出蘇云金芽孢桿菌檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，10分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。

本發明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術測定蘇云金芽孢桿菌，檢測時，將被測樣品加在試紙條(卡)上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應的結果，完成樣品檢測。本發明可用于檢測樣本中可能存在的蘇云金芽孢桿菌，具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經濟實用等特點。