[發明專利]環介導恒溫擴增技術快速檢測鏈狀亞歷山大藻的方法

無效

• 申請號: 201010173310.5
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101942507A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發明（設計）人: 蔣科技;張鳳英;馬春艷;馬凌波
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬鏈狀亞歷山大藻的DNA分子檢測領域，特別是涉及一種環介導恒溫擴增技術快速檢測鏈狀亞歷山大藻的方法。

背景技術

近年來，我們沿海多次發生赤潮危害，對漁業造成巨大經濟損失，對環境和生態平衡也造成嚴重的影響。

鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium?catenella)是一種有毒赤潮藻類，可產生麻痹性貝毒(Paralytic?Shellfish?Poison)等毒素，對浮游動植物、甲殼類、貝類、魚類等的存活、繁殖和發育存在非常不利的影響，食用被這種赤潮藻污染的魚和貝類則會直接威脅人類的健康。鏈狀亞歷山大藻在我國南北海域都具有分布，因此，嚴密檢測該藻種是海洋檢測工作中的重要內容。據此進行赤潮的預測預報，對于減少水產養殖業損失，保護海洋生態環境，有著重要的實際意義。

傳統的鏈狀亞歷山大藻的鑒別檢測方法是形態觀察，依賴于細胞結構的顯微觀察，對操作者有較高的專業要求，而且由于藻類之間相似程度較高，環境對藻類的形態也有較大影響，此方法存在較大的局限性。

現代分子生物學的進步使得各種技術應用到藻類鑒定中，如核糖體序列分析、RFLP、RAPD、PCR鑒定、熒光原位雜交等，從一定程度上提高了檢測的水平，降低了檢測難度。其中應用于亞歷山大藻的鑒定的有PCR鑒定、熒光原位雜交等。但PCR技術的最低檢測極限仍較高，檢測時間較長(3個小時左右)，而且需要精密的儀器。由于提取的藻DNA模板中含有多糖、蛋白質等，會抑制PCR反應，檢測效果不理想。熒光原位雜交技術也可用于亞歷山大藻的檢測，但操作步驟繁瑣，儀器要求和操作要求高，費用成本大，同樣難以方便地加以應用。實時熒光定量PCR檢測也是近年來微藻檢測的一個方向，這種方法非常靈敏，所需時間也不長(大概一個多小時)，但是所需實驗儀器(熒光定量PCR儀)價格昂貴，實驗操作要求也較高。

日本學者Notomi等于2000年開發了一種新的恒溫核酸擴增方法，即環介導等溫擴增反應(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在等溫條件(65℃左右)下保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。此反應不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，而且結果判定簡單，既可以利用儀器檢測或肉眼觀察核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀判定，也可以采用肉眼觀察反應液的顏色變化來迅速判定。

這種技術已經廣泛應用到病原菌檢測方面，取得理想的檢測效果。但迄今為止，尚未見將該技術應用于對鏈狀亞歷山大藻檢測鑒別的相關文獻報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種環介導恒溫擴增技術快速檢測鏈狀亞歷山大藻的方法，該方法具有操作簡單快速、對儀器要求不高、特異性強、擴增效率高、結果判定簡單等優點，適合對鏈狀亞歷山大藻快速鑒定和檢測，在赤潮的預測預報中發揮強大作用。

本發明的一種環介導恒溫擴增技術快速檢測鏈狀亞歷山大藻的方法，包括：

(1)赤潮藻類的基因組DNA提取

(2)LAMP擴增引物

(3)LAMP擴增反應體系

(4)LAMP擴增產物的檢測。

所述步驟(3)中的LAMP擴增反應體系所用試劑為：2.5uL?10×buffer(內含2mM的MgSO4)，2個內引物LZ-FIP1和LZ-BIP1的終濃度均為1.6μM，兩個外引物LZ-F31和LZ-B31的終濃度均為0.2μM，反應體系中另外還包含6mM?MgSO4，0.6mM?dNTP，0.6M?Betaine(Sigma-Aldrich)，8U?Bst?DNA聚合酶，1uL?DNA模板(45ng)；

所述步驟(3)中的LAMP擴增反應體系的條件為：反應溫度63℃，反應時間60min；

所述步驟(4)中的LAMP擴增產物檢測，反應管內可見到大量白色沉淀產生則呈陽性；或加2μL?100×SYBR?Green?I于反應管中，反應管呈現綠色為陽性，反應管內顏色不變為陰性。

本發明針對鏈狀亞歷山大藻核糖體間隔區的6個區域設計了4條特異性引物，利用這組引物成功檢測到鏈狀亞歷山大藻基因組DNA，并對其反應程序和反應體系進行了優化，建立起一種簡單快速的微藻檢測技術。