[發明專利]草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法

無效

• 申請號: 201010173210.2
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101864447A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 曾令兵;周勇;范玉頂;徐進;馬杰;肖藝
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/46;C07K14/14;C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 荊州市技經專利事務所 42219
• 代理人: 韓志剛

技術領域

本發明涉及到生物基因克隆表達技術領域，特別涉及到草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體構建及多克隆抗體的制備方法。

背景技術

草魚出血病是我國淡水魚類中傳染性高、致死性的病毒性魚病，其病原為草魚呼腸孤病毒(Grass?Carp?Reovirus，GCRV)。自從1979年Meyers分離出第一株水產類病毒以來，已有60多種水產類病毒被證實，其中很多病毒不會引起大規模發病或對水產養殖影響較小，而GCRV被認為是致病性最高的水產類病毒。因此GCRV可以作為研究水產類病毒復制和發病機理的模型，這對研究水產類病毒性疾病有重大意義。

草魚呼腸孤病毒為水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus，ARV)，呈二十面體對稱的球形，其基因組由11條分段的dsRNA片段組成。由于水生呼腸孤病毒至今尚未建立標準血清型，目前該屬亞型的劃分是以RNA：RNA雜交為依據進行歸類。ARV分為七個亞型(A-G)，G亞型代表草魚呼腸孤病毒。草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)分子量約為34KD，含1個鋅指序列調節基因表達。該蛋白具有協同其他蛋白通過構象變化行使膜穿透功能，還可能在病毒識別和進入宿主細胞的過程中起著識別接受器的作用。

發明內容

本發明的目的是將草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因克隆至原核表達質粒中，并在大腸桿菌中大量表達和純化，經免疫小鼠，以得到特異性好，濃度高的抗體，從而能大量制備出廉價的、高質量的抗草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)的抗體。

為達到上述目的，本發明的具體技術方案為：

草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法至少包括：病毒RNA提取、PCR擴增、酶切、連接、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因測序及原核表達載體構建、感受態細胞的制備與重組質粒的轉換、重組克隆的篩選及酶切鑒定。

草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法的具體步驟如下：

1、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA；

2、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因，PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產物；

3、將pET-32a(+)質粒和回收產物雙酶切，分別回收pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段；

4、將pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16～25℃過夜連接；

5、用連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞；

6、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28～37℃震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒分別進行酶切鑒定和PCR鑒定；

7、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37℃培養過夜，菌落PCR鑒定陽性克隆。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28～37℃200r/min1搖菌培養過夜，按1∶100比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，28～37℃200r/min至OD₆₀₀值達到0.5，在28～42℃條件下，使用不同IPTG濃度(0.1～2mol/L)和不同的誘導時間(1～24h)進行誘導表達；

8、將誘導過的重組菌株于4℃4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心20-60分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100～200μl?PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液100～200ul(含β巰基乙醇)，煮沸5～10分鐘后取10μl進行SDS-PAGE；

9、純化重組蛋白；

10、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠，20天后加強免疫，取重組蛋白稀釋于碳酸緩沖液，包被抗原，經封閉后將Balb/c小鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，孵育，用含吐溫20的PBS洗，加入酶標二抗，孵育，PBS洗，加入OPD，待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果(OD₄₉₂)。

草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法的具體步驟中的步驟2中PCR反應條件為：

1、95℃預變性5分鐘；

2、94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘為一個循環，共進行30個循環；

3、72℃延伸8-10分鐘。

本發明的積極效果為：