[發(fā)明專利]草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及多克隆抗體制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010173210.2
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101864447A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾令兵;周勇;范玉頂;徐進(jìn);馬杰;肖藝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/46;C07K14/14;C07K16/10;C07K16/06
• 代理公司: 荊州市技經(jīng)專利事務(wù)所 42219
• 代理人: 韓志剛

1.一種草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及多克隆抗體制備方法，其特征在于：草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達(dá)載體構(gòu)建及多克隆抗體制備方法至少包括：病毒RNA提取、PCR擴(kuò)增、酶切、連接、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因測序及原核表達(dá)載體構(gòu)建、感受態(tài)細(xì)胞的制備與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)換、重組克隆的篩選及酶切鑒定、蛋白的表達(dá)純化，注射小鼠，血清的采集。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及多克隆抗體制備方法，其特征在于，該表達(dá)載體構(gòu)建制備方法的具體步驟如下：

(1)、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細(xì)胞總RNA；

(2)、通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產(chǎn)物；

(3)、將pET-32a(+)質(zhì)粒和回收產(chǎn)物雙酶切，分別回收pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段；

(4)、將pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16～25℃過夜連接；

(5)、用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞；

(6)、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28～37℃震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定；

(7)、將轉(zhuǎn)化過重組質(zhì)粒的BL21涂布于LB固體平板，37℃培養(yǎng)過夜，菌落PCR鑒定陽性克隆。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28～37℃?200r/min1搖菌培養(yǎng)過夜，按1∶100比例接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，28～37℃?200r/min至OD₆₀₀值達(dá)到0.5，在28～42℃條件下，使用不同IPTG濃度(0.1～2mol/L)和不同的誘導(dǎo)時間(1～24h)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

(8)、將誘導(dǎo)過的重組菌株于4℃?4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心20-60分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100～200μl?PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液100～200ul(含β巰基乙醇)，煮沸5～10分鐘后取10μl進(jìn)行SDS-PAGE；

(9)、純化重組蛋白；

(10)、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經(jīng)腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠，20天后加強(qiáng)免疫，取重組蛋白稀釋于碳酸緩沖液，包被抗原，經(jīng)封閉后將Balb/c小鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設(shè)1陰性血清對照，孵育，用含吐溫20的PBS洗，加入酶標(biāo)二抗，孵育，PBS洗，加入OPD，待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標(biāo)儀讀取結(jié)果(OD₄₉₂)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建及多克隆抗體制備方法的具體步驟，其特征在于，上述步驟(2)中PCR反應(yīng)條件為：

(1)、95℃預(yù)變性5分鐘；

(2)、94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘為一個循環(huán)，共進(jìn)行30個循環(huán)；

(3)、72℃延伸8-10分鐘。