[發明專利]惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶的原核表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201010172232.7
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101864446A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 陳麗梅;張婧;孟慶超;年洪娟;李昆志
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術領域

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶蛋白(PADH)的原核表達載體pET28a-PADH及其在PADH蛋白的原核表達和制備PADH重組蛋白中的應用。

背景技術

甲醛在自然界中廣泛存在，主要通過含甲基或甲氧基團的化合物如木質素和果膠的降解過程產生。甲醛也是工業生產中用于制造樹脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的主要原料。室內空氣中游離的甲醛主要來源于建筑材料、家具、各種粘合劑以及合成織品等，甲醛由于存在板材內部，揮發期可長達3～15年，裝修后一兩年內難以完全揮發掉。在城市空氣中，甲醛主要來自機動車尾氣排放，在大氣中含量很高。高濃度的甲醛對神經系統、免疫系統、肺和肝臟等都有毒害作用，長期接觸甲醛的人，容易引起鼻腔、口腔、皮膚和消化道的癌癥，還可能導致白血病。目前，甲醛的危害及其去除的研究已經引起國內外眾多學者的關注。但是，大多集中在其危害病理學方面，治理技術方面主要是物理和化學方法居多，存在成本高、裝置復雜、治標不治本等特點。如何清除空氣中污染的甲醛已經成為關系到人類健康亟待解決的問題，但是目前還沒有一個有效的解決辦法，現代生物技術的應用為解決這一難題提供了新思路。

甲醛是一個十分活躍的化合物，能與蛋白質、核苷酸共價交聯反應，但它也作為一個內源代謝物產生于所有生物中，在體內甲醛可通過5，10-亞甲基四氫葉酸自發解離產生，此外各種DNA和RNA脫甲基化反應都會產生低濃度的甲醛。在長期的進化過程中，幾乎所有生物對甲醛都有各自的解毒機制，用以阻止甲醛的致命以及突變作用。生物體在長期進化中已經建立了一些應對甲醛毒害的解毒機制，因此利用生物甲醛代謝途徑關鍵酶來治理甲醛污染，具有經濟、環保、不產生二次污染等優點。由于生物體中這些酶的表達水平較低，難以純化。

國內外建立許多檢測空氣中甲醛含量的方法，如分光光度計法、氣相層析、高效液相層析和極譜法等，但對甲醛的酶法檢測研究卻很少。利用甲醛脫氫酶的催化特性進行甲醛的酶法檢測，不僅費用低而且操作簡單，適合于工作場合的日常使用。Vianello等把甲醛脫氫酶偶合在場效應晶體管上，通過離子場效應敏感晶體管檢測空氣中甲醛的含量，其檢測限可以達到0.1μg/mL，遠低于職業接觸的臨界值。

生化和遺傳學研究表明GSH-依賴的甲醛解毒途徑是自然界廣泛存在的一個修復系統，在絕大多數原核(除了古細菌)和所有的真核生物中都發現有這個修復系統。甲醛脫氫酶(formaldehyde?dehydrogenase，ADH，EC?1.2.1.1)是中等鋅鏈醇脫氫酶家族的一員，廣泛存在于從大腸桿菌到人類的多種生物體中.大多數的甲醛脫氫酶都需要NAD⁺和GSH參與甲醛的氧化，來自惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas?putida)的甲醛脫氫酶(PADH，EC?1.2.1.46)則是不需另外添加GSH而依賴NAD⁺催化甲醛氧化的酶。純化的PADH是個由四個相同亞基組成的同型四聚體，每個亞基由398個氨基酸殘基組成，其相對分子量大約為42kDa(Ando等，J.Biochem，1979，85：1165-1172)。由于PADH具有一些獨特的生化特性，如可以直接利用甲醛做底物將其氧化為甲酸，因此該酶可以應用于甲醛污染的生物治理。用較低的成本和簡便的方法快速生產并純化有活性的PADH蛋白是滿足其廣泛應用的必需條件，PADH蛋白特異性抗體是檢測植物中PADH蛋白表達水平的有效工具，其抗體的制備在現有研究中還未見報道。

發明內容：

本發明的目的是提供一種PADH的原核表達載體(pET28a-PADH)，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點和PADH基因及一個組氨酸標簽，利用該載體轉化大腸桿菌(Rosetta)，可實現PADH蛋白的高水平表達，表達的重組蛋白質40％以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30％)，60％存在于包涵體中，通過割膠純化從上包涵體中很容易獲得高純度的重組蛋白質，用于抗體的制備。用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，用于PADH酶制劑的生產及其生化特性分析。純化PADH蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

PADH的原核表達載體pET28a-PADH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和PADH基因及一個組氨酸標簽。