[發明專利]惡臭假單胞菌谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶的原核表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 201010172232.7
• 申請日: 2010-05-14
• 公開（公告）號: CN101864446A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 陳麗梅;張婧;孟慶超;年洪娟;李昆志
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.PADH的原核表達載體pET28a-PADH，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和PADH基因及一個組氨酸標簽。

2.如權利要求1所述的原核表達載體，所述載體中的谷胱甘肽-非依賴型甲醛脫氫酶基因PADH來源于惡臭假單胞菌，在GenBank中的登錄號為D21201。

3.如權利要求1所述的原核表達載體，所述PADH基因的上游有T7啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠PADH基因的起始密碼子上游還有一個組氨酸標簽序列。

4.如權利要求1所述的原核表達載體，由下述方法構建而得：

(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物：

PADH5：5’-CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3’

PADH3：5’-CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3’

5’端引物含有CATATG特征序列，并由此形成Nde?I酶切位點；3’端加CTCGAG特征序列，由此形成Xho?I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的全長。

(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD?18-PADH；

(3)構建原核載體pET28a-PADH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD18T-PADH和pET28a，并回收純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切檢測，獲得原核表達載體pET28a-PADH。

5.權利要求1-4的原核表達載體的制備方法，包括下述步驟：

(1)從GenBank中查找惡臭假單胞菌中PADH的全長基因序列，并設計序列如下的一對引物：

PADH5：5’-CATATGTCTGGTAATCGTGGTGTCG-3’

PADH3：5’-CTCGAGGGCCGCGCTGAAGGTCTTGTG-3’

5’端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde?I酶切位點；3’端加CTCGAG特征序列，由此形成Xho?I酶切位點。以惡臭假單胞菌的基因組為模版擴增，得到PADH基因的全長。

(2)回收并純化PADH全長基因片段，并將其連接到pMD18-T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過酶切檢測獲得重組質粒pMD18-PADH；

(3)構建原核載體pET28a-PADH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD18T-PADH和pET28a，并回收純化PADH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉化、抽提質粒進行單、雙酶切檢測，獲得原核表達載體pET28a-PADH。

6.權利要求1-4的原核表達載體在制備重組PADH蛋白中的應用。

7.權利要求1-4的原核表達載體在制備PADH抗體的抗原中的應用。

8.應用權利要求1-4所述原核表達載體制備PADH重組蛋白的方法，用0.5mMIPTG于30℃誘導4小時后使PADH重組蛋白達到較高的表達量，表達的重組蛋白質40％以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白30％)，60％存在于包涵體中，通過割膠純化從包涵體中獲得高純度的PADH重組蛋白質，可作為抗原用于PADH特異性抗體的制備。用親和層析從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組PADH蛋白質，可用于PADH酶制劑的生產及其生化特性分析。