[發明專利]一種用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的新方法

無效

• 申請號: 201010170675.2
• 申請日: 2010-05-13
• 公開（公告）號: CN101810866A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 彭蘊茹;韋英杰;丁永芳;羅宇慧;石磊
• 申請（專利權）人: 江蘇省中醫藥研究院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K33/00;A61P1/16
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技術領域

本發明涉及一種藥物的篩選方法，具體涉及一種用模式生物斑馬魚快速篩選抗肝損傷藥物的新方法。

背景技術

抗肝損傷藥物篩選研究常包括體內(動物)和體外(細胞、分子等)試驗。體內抗肝損傷試驗常采用小鼠、大鼠等動物進行，主要的肝損傷模型有急性肝損傷模型和慢性肝損傷模型研究。其中對于抗肝損傷藥物的快速篩選目前大多選用小鼠急性肝損傷模型，但由于小鼠體內實驗所需藥物用量大，實驗成本高，不利于少量藥物的快速篩選，尤其是從中藥中提取得到的單體化合物的量有時極少，用小鼠模型篩選抗肝損傷藥物受到了限制。體外抗肝損傷藥物篩選研究多采用細胞、分子等方法，方法簡單、條件可控，適用于肝損傷藥物的快速初篩，但離體細胞、分子等難以精確地模擬復雜的體內過程，試驗過程常出現假陽性結果。因此，建立一種既能較好的模擬在體過程，又能快速方便預測抗肝損傷藥物的保肝功效的研究方法具有重要意義。斑馬魚是一種極好的模式生物，是取代青蛙、果蠅、小白鼠等作為研究對象的優良試驗模式魚。斑馬魚喂養和維持的費用更便宜，所需空間場地不大，易于室內大規模繁殖。成體魚長3～4cm，一次交配能獲得100～200個胚胎，每周產卵一次，這樣中等規模的魚缸每年就能養殖成魚數百萬只，成本僅為養小鼠的0.1％-1％。斑馬魚同人類基因的相似度與小鼠相當，且在蛋白質水平上，其關鍵部位的同源性幾乎是100％，所以可用斑馬魚模擬人類疾病。目前，人們已成功的用斑馬魚建立許多人類疾病模型，如神經系統、循環系統、聽覺、視覺、癌癥等方面的疾病。如中國專利200810019040.5公開了一種用斑馬月魚研究藥物毒性的方法，專利200780051025.2公開了一種通過干細胞營養進行的器官的形成和以及酒精損傷器官的再生方法，200310108710.8公開了利用斑馬魚基因治療截癱等疾病，斑馬魚已在國內外成為一種熱門的藥學研究工具，目前斑馬魚的研究主要限于發育遺傳學方面，尚未見在抗肝損傷藥物研究方面的應用。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種操作方便、成本低、實驗結果準確、所需受試藥物量少，用模式生物斑馬魚快速篩選出抗肝損藥物的新方法。

技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

一種用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的新方法，具體包括以下步驟：

(1)取斑馬魚的成體魚放入盛有水的容器里，隨即分為正常對照組、空白對照組、受試藥物組，每組斑馬魚數量相等，空白對照組和受試藥物組加入四氯化碳，使四氯化碳的摩爾濃度為0.5～2mmol/L，正常對照組加入等量的溶媒，持續造模3～5天，即得急性肝損傷斑馬魚模型，備用；

(2)將受試藥物配成所需濃度，加入到受試藥物組的水溶液中，正常對照組和空白對照組加入等量的蒸餾水，給藥48小時至72小時后，將各組斑馬魚取出處死，取各組斑馬魚肝臟隨機分為2份，一份制成1％的肝組織勻漿，檢測勻漿中ALT、AST水平和總蛋白含量，并計算勻漿中每克蛋白的ALT、AST水平，另一份肝臟組織標本經濃度10％福爾馬林溶液固定，石蠟切片，H-E染色，光鏡下觀察各組斑馬魚肝組織的病理改變情況，進行病理分級評分，正常為1分，輕微脂肪變性為2分，中度病變為3分，脂肪變性嚴重者為4分，評價并篩選各組受試藥物的抗肝損傷活性。

作為優選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的新方法，其中步驟(1)用四氯化碳造模時，四氯化碳的終摩爾濃度為1mmol/L。因為四氯化碳的濃度如果太高，可能會對斑馬魚產生嚴重的毒性，導致斑馬魚大量死亡，從而使造模實驗失敗，但是如果四氯化碳的濃度過低，不能對斑馬魚的肝臟產生損傷，同樣也不能得到符合要求的急性肝損傷模型，本發明通過對不同濃度的四氯化碳濃度進行篩選，以斑馬魚肝損傷為評價指標，得出最佳造模所需的四氯化碳濃度為1mmol/L。

作為優選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的新方法，其中步驟(1)造模時所用的四氯化碳的極性比較小，不能很好的溶解在水溶液里，從而影響造模的成功，本發明在四氯化碳中加入適量二甲基亞砜即DMSO作為助溶劑，控制二甲基亞砜在溶液中的終濃度為0～1％，對斑馬魚的正常活動無影響，而正常對照組中相應加入等量的DMSO，以保證實驗的科學性。