[發明專利]一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法

無效

• 申請號: 201010170371.6
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101852720A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 呂瀟;黎秀卿;苑學霞;鄧立剛;鄭紅;趙善倉;郭長英;張紅;王文正;汝醫
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院中心實驗室
• 主分類號: G01N21/17
• 分類號: G01N21/17;G01N1/28
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 王汝銀

技術領域

本發明涉及一種檢測萊克多巴胺殘留的方法，特別涉及豬肉中萊克多巴胺殘留的生物傳感器測定方法。

背景技術

萊克多巴胺(ractopamine，Rac)屬于苯乙胺類-β₂受體激動劑，見結構式如下所示：

Rac起初主要用于治療支氣管哮喘、阻塞性肺炎，痙攣等癥狀。后來發現它和鹽酸克倫特羅一樣，有營養再分配的作用，抑制脂肪的合成，促進蛋白質的積累，從而提高胴體的瘦肉率，但人體的攝入量超過了一定值后，就會發生頭痛，胸悶等不良反應，因此歐盟和我國先后都頒布法令禁止在畜禽生產中使用該類藥物。

現存的檢測豬肉中萊克多巴胺的方法有以下幾種。

酶聯免疫(ELISA)法，是利用抗原抗體特異性結合的原理來檢測樣品中藥物的一種方法。如Shelver?W?L，Smith?D?J.J.Agric.Food?Chem.，2002，50(10)：2742～2747。但是此方法需要標記，而且反應時間比較長。

氣相色譜質譜聯用法，如應永飛，陸春波，任玉琴，吳平谷，林仙軍.中國獸藥雜志，2006，40(5)：23～26.此方法需要衍生化，一方面衍生化試劑比較昂貴，另一方面衍生化過程不僅消耗時間，還會產生許多副產物，從而影響檢測結果的準確性。

液相色譜質譜聯用法，因不需衍生化最近幾年被普遍使用，而且靈敏度高，特異性好，如M?L，Churchwell，C?L?Holder，D?Little，S?Preece，D?J?Smith，D?R?Doerge.RapidCommun，Mass?Spectrom.2002；16：1261-1265.但對操作人員的專業能力要求很高，機器運轉，前處理所需要的固相萃取柱的成本也很昂貴。

生物傳感器檢測萊克多巴胺殘留的方法國內還沒有涉及，國外對萊克多巴胺的檢測涉及也很少，如W.L.Shelver，D.J.Smith.Agric.Food?Chem.2003，51，3715-3721.，只是涉及到尿樣的檢測。如Thompson?C?S，Haughey?S?A，Traynor?I?M，Fodey?T?L，Elliott?C?T，Antignac?JP，Bizec?B?L，Crooks?S?R?H.，Anal.Chim.Acta，2008，608(2)：217～225.雖然對動物源性食品進行了檢測，但對樣品的基質效應并沒有系統的討論，對前處理也沒做出優化處理。

發明內容

本發明旨在運用表面等離子諧振原理，提供一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法。此方法樣品前處理相對簡單，去除基質干擾能力強，成本低，無需標記，還能實現實時自動檢測，克服現有技術存在的上述缺點。

本發明的技術方案是：利用了競爭抑制反應的原理，在芯片表面固定上萊克多巴胺衍生物，然后將萊克多巴胺抗體和含有萊克多巴胺的樣品混合后注射到芯片表面，則樣品中萊克多巴胺將抑制抗體與芯片表面萊克多巴胺衍生物的結合。利用樣品中萊克多巴胺含量與抗體與芯片表面萊克多巴胺衍生物的結合相對響應值成反比，來檢測樣品中的萊克多巴胺的殘留量。

本發明的具體步驟如下：

(1)豬肉樣品的前處理

稱取勻質好的豬肉樣品，加入提取液，渦旋震蕩，調PH為1.0，離心過濾后，濾液調PH到11，然后加入萃取液，震蕩混勻，離心后移取上清液，重復萃取一次，合并上清液，氮氣吹干后，用復溶液溶解后超聲混勻，離心，過濾膜后，待生物傳感器檢測；

(2)萊克多巴胺衍生物的固定

首先將EDC(N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亞胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)混合后，對修飾有羧甲基化葡聚糖的芯片表面進行活化，然后將萊克多巴胺衍生物用醋酸緩沖溶液稀釋后注入芯片表面，反應一段時間后，最后用乙醇胺滅活多余的酯鍵；

(3)豬肉樣品中萊克多巴胺的殘留檢測

將步驟(1)制備的樣品溶液與含有萊克多巴胺抗體的PBS緩沖液混合后，注入芯片表面反應，記錄反應前后響應值的變化，然后通入HCl對芯片進行再生，每次通入樣品前后都要通入含1％甲醇的PBS緩沖液，為了使基線平衡，并消除非特異性結合；

(4)分析檢測結果