[發(fā)明專利]一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010170371.6
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101852720A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂瀟;黎秀卿;苑學(xué)霞;鄧立剛;鄭紅;趙善倉;郭長英;張紅;王文正;汝醫(yī)
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號: G01N21/17
• 分類號: G01N21/17;G01N1/28
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 王汝銀

1.一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)豬肉樣品的前處理

稱取勻質(zhì)好的豬肉樣品，加入提取液，渦旋震蕩，調(diào)PH為1.0，離心過濾后，濾液調(diào)PH到11，然后加入萃取液，震蕩混勻，離心后移取上清液，重復(fù)萃取一次，合并上清液，氮?dú)獯蹈珊螅脧?fù)溶液溶解后超聲混勻，離心，過濾膜后，待生物傳感器檢測；

(2)萊克多巴胺衍生物的固定

首先將EDC和NHS混合后，對修飾有羧甲基化葡聚糖的芯片表面進(jìn)行活化，然后將萊克多巴胺衍生物用醋酸緩沖溶液稀釋后注入芯片表面，反應(yīng)一段時(shí)間后，最后用乙醇胺滅活多余的酯鍵；

(3)豬肉樣品中萊克多巴胺的殘留檢測

將步驟(1)制備的樣品溶液與含有萊克多巴胺抗體的PBS緩沖液混合后，注入芯片表面反應(yīng)，記錄反應(yīng)前后響應(yīng)值的變化，然后通入HCl對芯片進(jìn)行再生，每次通入樣品前后都要通入含1％甲醇的PBS緩沖液；

(4)分析檢測結(jié)果

用含1％甲醇的PBS緩沖液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成一組工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中抗體的最終稀釋度為1∶200，萊克多巴胺的終濃度為0、1、2、5、10、20ng/mL，然后按隨機(jī)順序通入芯片，以每個(gè)濃度下的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的相對響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，在檢測實(shí)際樣品時(shí)，根據(jù)樣品所得的相對響應(yīng)值，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中藥物含量。

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(1)提取液為高氯酸。

3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(1)萃取液優(yōu)選為乙酸乙酯。

4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(1)復(fù)溶液為體積比1∶9的甲醇∶PBS緩沖液。

5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(1)高速離心的轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為10分鐘。

6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(1)為：稱取5g勻質(zhì)好的豬肉樣品，加入20mL?0.1M的高氯酸，渦旋震蕩3min，調(diào)pH為1.0，以4000rpm離心10min，過濾后，濾液用1M的氫氧化鈉調(diào)pH到11，然后加入10mL乙酸乙酯，震蕩混勻，以4000rpm離心10min離心后移取上清液，再在殘余物中加入10mL乙酸乙酯，重復(fù)萃取一次，合并上清液，在40℃水浴下氮?dú)獯蹈珊螅瑥?fù)溶于250uL的體積比為1∶9的甲醇∶PBS溶液中，超聲混勻30s，以10000rpm離心10min，離心后，取上清液過0.22um濾膜后，取25uL供生物傳感器檢測。

7.如權(quán)利要求1或6所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(2)萊克多巴胺衍生物的固定為：

a活化：將體積比1∶1的0.4M?EDC和0.1M?NHS混合后，以10μL/min的流速對修飾有羧甲基化葡聚糖的芯片表面進(jìn)行活化，活化時(shí)間為7min；

b固定：將萊克多巴胺衍生物用pH＝4.6的0.2M的醋酸緩沖溶液稀釋100倍，然后以10μL/min的流速注入芯片表面反應(yīng)10min；

c滅活：用1M乙醇胺以10uL/min的流速注入7min，滅活多余的酯鍵。

8.如權(quán)利要求7所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(3)豬肉樣品中萊克多巴胺的殘留檢測為：將樣品提取液與含有萊克多巴胺抗體的PBS緩沖液按照體積比1∶9的比例混合，其中萊克多巴胺抗體的最終稀釋度為1∶200，以10μL/min的流速注入芯片表面反應(yīng)10min，記錄反應(yīng)前后響應(yīng)值的變化，然后以20uL/min流速通入0.1MHCl再生3min，每次通入樣品前后都要通入含1％甲醇的PBS緩沖液。

9.如權(quán)利要求1或8所述的一種檢測豬肉中萊克多巴胺的生物傳感器方法，其特征是，所述步驟(4)標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制為：首先稱取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品10mg，先用甲醇溶解為10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于-20℃保存，然后用pH＝7.4的PBS緩沖液稀釋到1ug/mL的中間液，密封保存于4℃。