[發(fā)明專利]一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010169838.5
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN102041242A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉鴻君;沈國林
• 申請（專利權(quán)）人: 北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

肝臟是藥物代謝的主要場所，大部分藥物經(jīng)口服或肌注后經(jīng)血液傳輸首先到達(dá)肝臟進(jìn)行代謝然后進(jìn)入血液循環(huán)，這就是肝臟的首過效應(yīng)。因?yàn)楦闻K是重要的體內(nèi)代謝部位，藥物的轉(zhuǎn)化大部分在肝臟內(nèi)完成，所以新藥的初期研發(fā)必需要研究肝臟對藥物代謝的影響。其主要內(nèi)容包括藥物在肝臟內(nèi)的代謝分解速度，主要的代謝途徑，主要代謝產(chǎn)物以及參與該化合物代謝主要肝臟酶體系。同時藥物對肝臟的毒性作用也需做出相應(yīng)的評估，所有這些信息對于藥物的早期篩選都有著重要的意義。

肝原代細(xì)胞有以下優(yōu)點(diǎn)：可同時獲得大量性狀同一的標(biāo)本，與體內(nèi)情況保持一致，可以在接近生理狀態(tài)的情況之下研究藥物的代謝等等。經(jīng)過夾心培養(yǎng)處理的長期培養(yǎng)的單層肝原代細(xì)胞可形成類似膽小管結(jié)構(gòu)并表達(dá)出肝細(xì)胞特有的載體，從而可進(jìn)一步用于化合物經(jīng)膽汁排泄的可能性進(jìn)行評價。特別是人肝原代細(xì)胞可以作為藥物早期篩選的最佳模型來研究藥物對肝細(xì)胞的活性影響。

肝原代細(xì)胞的分離國外已經(jīng)有報(bào)道，通過進(jìn)行肝灌流獲得肝原代細(xì)胞，采用膠原凝膠夾層法培養(yǎng)肝原代細(xì)胞。國內(nèi)現(xiàn)在原代肝細(xì)胞的分離只能在完整的肝臟組織下才能操作，對于肝臟組織塊或者細(xì)小的肝組織的灌流未見報(bào)道，對于夾心法培養(yǎng)原代肝細(xì)胞也只采用膠原凝膠的方法。

肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在國內(nèi)還沒有形成一套特定而成熟的分離和培養(yǎng)體系，特別是對肝臟組織塊的肝細(xì)胞分離還沒有報(bào)道，國內(nèi)制備肝原代細(xì)胞還屬空白領(lǐng)域，僅僅具備活體原位灌流技術(shù)無法滿足作為藥物篩選的需求，特別是人的肝原代細(xì)胞由于倫理方面的限制，獲得整塊人肝的可能性幾乎為零，但藥物篩選最好的載體就是人的肝原代細(xì)胞，最接近藥物作用的實(shí)際情況，國內(nèi)在人肝細(xì)胞的研究這方面幾乎為零，這對國內(nèi)藥物研發(fā)領(lǐng)域的企業(yè)和科研院所來說成為了一個阻礙其藥物研發(fā)進(jìn)度的關(guān)鍵點(diǎn)，通過對肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)的突破，將極大的促進(jìn)藥物研發(fā)的進(jìn)度和效率，也可以降低研發(fā)的成本。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種肝原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，它能解決國內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。

為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案：(a)：將切除的不完整肝臟組織塊通過粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個可供灌流的進(jìn)液血管口和一個出液血管口；(b)：插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以防漏液；(c)：放入36～42℃水浴鍋內(nèi)漂浮的容器中，開始灌輸36～42℃的無鈣灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(d)：清空無鈣灌流液，灌輸36～42℃的0.03～0.10％膠原酶灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(e)：將完全消化好組織分離出肝細(xì)胞，通過Percoll溶液離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細(xì)胞。

所述的無鈣灌流液(pH7.4)配方為：NaCl?8.0～9.0g·L^-1?KCl0.4～0.6g·L^-1?HEPES2.0～4.0g·L^-1?NaOH?0.2～0.4g·L^-1?維生素C?50～100μg·mL^-1?胰島素2～4μg·mL^-1，流速25～50ml/min，時間5～20min。

所述的酶灌流液(pH7.6)配方為：NaCl?3.0～5.0g·L^-1?KCl0.2～0.6g·L^-1?CaCl₂0.5～1.0g·L^-1?HEPES?20～30g·L^-1?NaOH2.5～5.0g·L^-1?膠原酶濃度0.04～0.08％?維生素C?50～100μg·mL^-1?胰島素2～4μg·mL^-1，流速25～50ml/min，時間5～20min。

所述的Percoll分離液是：90％Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS(10*)，然后加入培養(yǎng)液配成20～70％Percoll溶液。

本發(fā)明具有以下以下有益效果：解決國內(nèi)制備肝原代細(xì)胞領(lǐng)域的空白，肝細(xì)胞的培養(yǎng)采用“三明治膠”夾層法，能夠使其保持較長時間的活力，解決了肝細(xì)胞沒有像細(xì)胞系那樣的增殖性而活性無法保持的問題。

附圖說明：