[發(fā)明專利]一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010169838.5
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN102041242A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉鴻君;沈國林
• 申請（專利權(quán)）人: 北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于(a)：將切除的不完整肝臟組織塊通過粘性溶劑封閉多余的血管管路，只保留一個可供灌流的進液血管口和一個出液血管口；(b)：插入合適大小的針頭，用粘性溶劑封住，等粘性溶劑干之后再涂一層粘性溶劑以防漏液；(c)：放入36～42℃水浴鍋內(nèi)漂浮的容器中，開始灌輸36～42℃的無鈣灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(d)：清空無鈣灌流液，灌輸36～42℃的0.03～0.10％膠原酶灌流液，控制灌流速度和灌流時間；(e)：將完全消化好組織分離出肝細胞，通過Percoll溶液離心獲得純化的仍保持活性的原代肝細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于所述的無鈣灌流液(pH7.4)配方為：NaCl?8.0～9.0g·L^-1KCl?0.4～0.6g·L^-1?HEPES2.0～4.0g·L^-1?NaOH?0.2～0.4g·L^-1維生素C?50～100μg·mL^-1?胰島素2～4μg·mL^-1，流速25-50ml/min，時間5-20min；酶灌流液(pH7.6)配方為：NaCl?3.0～5.0g·L^-1?KCl0.2～0.6g·L^-1?CaCl₂0.5～1.0g·L^-1?HEPES?20～30g·L^-1?NaOH2.5～5.0g·L^-1?膠原酶濃度0.04～0.08％維生素C?50～100μg·mL^-1?胰島素2～4μg·mL^-1，流速25-50ml/min，時間5-20min；Percoll分離液是：90％Percoll配制是9體積的Percoll加1體積的PBS(10*)，然后加入培養(yǎng)液配成20～70％Percoll溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于通過在細胞上下層鋪上相應(yīng)的膠使其能建立類似活體肝臟實質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)并保持長時間的活力及其穩(wěn)定的代謝功能；(a)在空白培養(yǎng)板上鋪上0.01～0.1mg/ml鼠尾膠，體積按照培養(yǎng)板每孔表面積的大小加入；(b)在鋪上細胞等待4～10小時之后，加入Matrigel膠或鼠尾膠，形成一個夾層，使肝細胞能模擬肝板樣生長結(jié)構(gòu)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于經(jīng)過鼠尾膠處理的培養(yǎng)板表面會形成一層蛋白薄膜，有利于肝細胞貼壁。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種肝原代細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于加入上層Matrigel膠或鼠尾膠之后，可以固定肝細胞的形狀，形成肝板樣結(jié)構(gòu)，使肝細胞具有較長的生存周期。