[發明專利]一種番石榴焦腐病菌分子檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010169775.3
• 申請日: 2010-04-24
• 公開（公告）號: CN101864484A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 陳慶河;翁啟勇;高新明;李本金;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及番石榴焦腐病菌分子檢測引物及其檢測方法，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。

背景技術

番石榴焦腐病是由番石榴焦腐病菌(Botryosphaeria?rhodina)侵染引起的一種毀滅性病害，由于番石榴果實采后生理代謝旺盛，鮮果易失水、褐變和腐爛。因此，采后番石榴的保鮮運輸成為生產上亟待解決的問題。研究發現番石榴采后貯藏期真菌性病害主要是由于番石榴焦腐病采前病原真菌的潛伏侵染造成的，同時認為采后病害(特別是真菌性病害)是影響番石榴果實貨架期的主要原因，而且番石榴焦腐病菌的分離頻率最高。該病害給番石榴的品質和外觀造成極大影響，嚴重降低其經濟價值。因此，開展番石榴焦腐病菌檢測，防止其從發病區向未發病區傳播，以及在其發病初期進行診斷檢測，對番石榴焦腐病的及時控制具有重要意義。

傳統的番石榴焦腐病菌檢測方法是采用選擇性培養基從植物組織中分離菌株，再對這些菌株的形態等進行鑒定，來確定是否存在番石榴焦腐病菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術對發病癥狀進行判定是否由番石榴焦腐病菌引起的病害。傳統的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經驗，最重要一點是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時期的需求，因此傳統病原學檢測方法已不能滿足現代植物病理學研究的需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期，且目前尚未見有關番石榴焦腐病菌快速檢測方法技術的報道。

隨著分子生物學技術的發展，應用PCR技術對病原菌進行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子已越來越多(Li?et?al，2003)。18S和28S間的ITS是較理想的真菌鑒定及檢測的PCR引物區域。在相近的真菌中，由于ITS序列不需翻譯，面臨較小的進化選擇壓，在進化過程中可以將突變保留積累下來，從而ITS包含許多差異序列。利用ITS序列的多態性獲得的特異性引物及PCR過程可以為病原菌的快速、準確檢測提供可靠的分子檢測工具，檢測過程只需要簡便的PCR和瓊脂糖電泳操作，為植物病害的防治提供依據。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中番石榴焦腐病菌的生物學檢測方法所需周期長、目前番石榴焦腐病菌分子檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種番石榴焦腐病菌的特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的番石榴焦腐病菌的快速分子檢測診斷的方法。該方法可用于帶菌的植物組織的高靈敏度快速分子檢測，此技術對于番石榴焦腐病菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。

實現本發明的目的包括下列步驟：

1.根據番石榴焦腐病核糖體rDNA-ITS序列的特異性，設計了對番石榴焦腐病菌具有特異擴增作用的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3′

下游引物BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′。

2.番石榴焦腐病菌特異分子檢測體系的建立

(1)從發病的番石榴植物組織中采用CTAB法提取DNA；

(2)以提取的DNA為模板上述的一對引物BF1/BR1通過PCR擴增；PCR反應體系25μl，包括2.5μl?10×PCR反應緩沖液，2.0mmol/L?Mg²⁺，50μmol/L?dNTPs，1.25U?Taq?DNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O補足25μl；PCR反應條件為：95℃預變性1min，94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30個循環；72℃延伸10min；

(3)然后取步驟(2)的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定結果；如果能特異性地擴增出287bp的產物，即可判斷所述的植物組織中存在了番石榴焦腐病菌。