[發明專利]一種16型人乳頭瘤病毒L2E7基因在大腸桿菌中的優化表達方法

有效

• 申請號: 201010169578.1
• 申請日: 2010-05-11
• 公開（公告）號: CN101845453A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 莊昉成;高孟;毛子安;田厚文;姜云水;李劍波;任皎;趙莉
• 申請（專利權）人: 浙江普康生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

1.一種16型人乳頭瘤病毒L₂E₇基因在大腸桿菌中的優化表達方法，其特征在于以16型人乳頭瘤病毒L₂E₇為目的基因，通過分子克隆技術構建得到16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組質粒，并在大腸桿菌中進行表達，從中篩選出具有高表達水平的重組菌株，最后從(1)培養基成分，(2)培養基pH條件，(3)誘導時機，(4)氨芐青霉素濃度，(5)接種量，(6)誘導劑，(7)誘導溫度七個方面對該重組工程菌的表達條件進行了比較；通過優化試驗，得出一系列優化表達條件：(1)含有1％葡萄糖的表達培養基，(2)培養基初始pH值7.0，(3)誘導時機為菌液在600nm波長下的光密度≈1.1，(4)氨芐青霉素濃度為50克/升，(5)接種量為5％，(6)異丙基硫代半乳糖苷濃度為0.25毫摩爾，(7)誘導溫度37℃，最終重組蛋白相對表達量為15％左右，包涵體得率接近13％。

2.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于通過基因克隆技術把16型人乳頭瘤病毒L₂E₇基因插入了表達載體，獲得了一株高表達16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組蛋白的表達菌株。

3.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于所用到的表達培養基配方為：七水磷酸氫二鈉12.8克，磷酸氫鉀3克，氯化鈉0.5克，氯化銨1克，1摩爾硫酸鎂2毫升，1摩爾氯化鈣0.1毫升，胰蛋白胨2.5-5克，酵母提取物2.5-5克，葡萄糖5-10克，加水至1000毫升。

4.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組蛋白的高效表達方案步驟如下：

(1)將表達16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組基因的大腸桿菌菌株，在菌種固體培養基上劃線培養，挑取單克隆菌落在3毫升菌種培養基中活化培養過夜；

(2)用于大腸桿菌表達16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組蛋白的培養基以M9培養基為基礎，選擇不同的初始葡萄糖濃度0.4％-6％，初始胰蛋白胨含量0.5％-1.0％以及初始酵母提取物含量0.5％-1.0％，將活化種子菌液按體積比5％的接種比例接種于100毫升培養基中，37℃下培養菌體在600nm波長下的光密度至0.2-2.0，然后加異丙基硫代半乳糖苷濃度至0.1-2毫摩爾進行誘導，在28-37℃條件下繼續培養3-6小時；

(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8％的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色；

(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity?one?4.6.2軟件分析圖片，計算蛋白的相對表達量。

5.根據權利要求4所述的優化表達方法，其特征在于所用到的菌種固體培養基配方為：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，瓊脂粉5克，加水至1000毫升，高壓滅菌。

6.根據權利要求4所述的優化表達方法，其特征在于所用到的菌種培養基配方為：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高壓滅菌。