[發明專利]一種16型人乳頭瘤病毒L2E7基因在大腸桿菌中的優化表達方法

有效

• 申請號: 201010169578.1
• 申請日: 2010-05-11
• 公開（公告）號: CN101845453A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 莊昉成;高孟;毛子安;田厚文;姜云水;李劍波;任皎;趙莉
• 申請（專利權）人: 浙江普康生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

技術領域

本發明屬于醫學生物技術領域，具體涉及16型人乳頭瘤病毒L₂E₇重組蛋白在大腸桿菌原核表達菌株的構建及其表達條件的優化。

背景技術

人乳頭瘤病毒(human?papillomavirus，HPV)是一類具有嚴格宿主范圍和組織特異性的病毒，主要感染人的皮膚或粘膜上皮細胞，引起感染部位發生病變。根據其生物學行為可以將其分為高危型和低危型兩大類。低危型人乳頭瘤病毒的感染可引起良性腫瘤或疣，如扁平疣、尖銳濕疣等；高危型人乳頭瘤病毒和宮頸癌的發生關系密切。大量分子流行病學和分子生物學研究已經證明，感染高危型人乳頭瘤病毒HPV16，HPV18，HPV31、HPV33，HPV45是宮頸癌發生的主要病因，其中16型HPV在宮頸癌患者中的檢出率達50％。宮頸癌占婦女因癌癥死亡原因的第二位，全世界每年有50萬新發病例，其中30萬人死于宮頸癌，我國每年因宮頸癌而死亡的人數大約為5萬人。

人乳頭瘤病毒的生物學特性：人乳頭瘤病毒(HPV)是直徑為55nm、約有8000bp的小DNA病毒，由環狀雙鏈DNA形成的20面體對稱的無包膜病毒，在氯化銫中浮密度為1.34g/ml。以HPV16為例其基因組分為3個區：E區、L區和非編碼區(UCR)，E區含8個早期開放閱讀框ORF(E1-E8)，分別編碼E1-E8早期蛋白，參與病毒DNA的復制、轉錄、翻譯調控和轉化等功能；L區含2個晚期開放閱讀框ORF(L1、L2)，編碼主要結構蛋白L1和次要結構蛋白L2；URR區含有HPV基因組DNA的復制起點和HPV表達所必需的調控元件。

高危型HPV的致癌特性主要由E6和E7這兩個編碼的早期蛋白引起的，E6蛋白包含4個Cys-X-X-Cys的保守序列，這些鋅指結構具有與DNA、RNA結合和介導蛋白一蛋白相互作用的功能，從而使病毒和宿主細胞發生整合。HPV整合人宿主細胞不僅使病毒的癌蛋白得到長期穩定的表達，而且因插入造成宿主DNA的重排，相應的基因紊亂，對細胞的惡性轉化起著重要作用。此外，E6蛋白還與野生型P53基因具有高度的親和性，二者極易結合促使后者快速降解，從而使正常細胞生長周期失去調控造成細胞無限增殖并向惡性轉化。

E7基因表達蛋白是一種只有98個氨基酸的小分子蛋白，其致癌過程主要通過作用于人體細胞的抑瘤蛋白pRB蛋白來實現。pRB蛋白是一種重要的生長抑制蛋白，在細胞周期調節中起關鍵作用。主要通過抑制某些轉錄因子(如E2F等)活性達到抑制細胞增殖的目的。正常情況下，非磷酸化的pRb與E2F轉錄因子形成pRb-E2F復合物，從而抑制E2F對靶基因的轉錄，抑制細胞增殖。當E7蛋白介入時，通過其結構上的Rb結合位點與非磷酸化的pRb結合，造成pRb-E2F復合物分離，E2F的轉錄作用得到了釋放，轉錄的基因使細胞由G1期進入S期，導致細胞周期無法調控，細胞實現“永生化”。

HPV病毒株很難從組織灶中分離得到，迄今為止還沒能建立起體外培養系統來進行病毒的培養，并且E6、E7蛋白具有轉化活性，完整的病毒顆粒不大可能被發展為疫苗，現在研制中的HPV疫苗大多屬于基因工程疫苗。這些疫苗根據其功能不同大致可分為兩大類，即預防性疫苗和治療性疫苗。

預防性疫苗研究較多的是病毒樣顆粒(virus?like?particles，VLPs)，通過誘發中和抗體來防止病毒的感染或再感染。在天然HPV病毒顆粒形成過程中，衣殼蛋白包裝病毒DNA形成成熟的病毒顆粒。研究表明，在許多表達體系如哺乳動物細胞、酵母和細菌中，單獨L1或L1和L2共表達后可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒(VLPs)，這種病毒樣顆粒與天然病毒顆粒有相似的空間構象、免疫特性和生物學活性。研究表明：HPV?VLPs能通過MHC?I途徑誘導產生細胞免疫。HPV16型L1裝配成的VLPs經鼻免疫小鼠后，可在脾及陰道淋巴組織中發生淋巴細胞增殖。以產生γ干擾素的CD4⁺T淋巴細胞增為主，髂骨淋巴細胞中增生的T淋巴細胞具有T細胞殺傷(CTL)活性，說明VLPs可誘導MHC?I類限制性CD8⁺反應。

因為VLPs不含病毒核酸，所以無潛在的致癌危險性，作為疫苗安全可靠。L1和L2共表達不僅可增加中和抗體的滴度，而且可加強病毒樣顆粒的裝配效率，提高VLPs的產量，同時還可能增加有關的抗原表位以便獲得較強的局部黏膜免疫和系統的體液免疫和細胞免疫反應。因此，以L1和L2為保護性抗原構建的疫苗在預防HPV感染及其相關腫瘤方面發揮著重要作用^[10]。