[發明專利]牦牛銅鋅超氧化物歧化酶重組表達蛋白質

無效

• 申請號: 201010169323.5
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101818166A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 徐亞歐;毛德才;毛亮;袁忠;楊德孝;鄭玉才
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N15/53;C12N1/21;C12N9/08;C12R1/19
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉雪蓮;劉明芳

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種構建牦牛Cu,Zn-SOD-pET22b(+)-E.coli?BL21(DE3)基因工程菌及IPTG誘導表達與重組蛋白質純化的技術。

背景技術

超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）是一類含有不同金屬離子的氧化還原酶，廣泛存在于自然界各種生物體內,?按所含金屬輔因子的不同，可將SOD分為3大類型：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。Cu,Zn-SOD?主要存在于真核生物胞漿中，另外在細胞核、溶酶體、過氧化物酶體中也有存在；Mn-SOD?在真核生物的線粒體及原核生物的胞漿中皆存在；Fe-SOD主要存在于葉綠體和原核生物中。Mn-SOD和Fe-SOD出現在生命進化的早期，而Cu,Zn-SOD是在以后的發展中單獨進化而成的。

Cu,Zn-SOD在脊椎動物中約占總SOD活性的80%以上，在人體內Cu,Zn-SOD含量最高。1938年，Mann和Keilin首次從牛紅細胞中分離出一種藍色的含銅蛋白質（Hemocuprein）。1968年，McCord和Fridovich等對Hemocuprein的功能進行研究，因其能催化超氧陰離子O₂^-的歧化反應而將其命名為超氧化物歧化酶（SOD），其作用主要是專一地清除生物氧化中產生的超氧陰離子自由基（superoxide?radical，O₂^-）等中間物的毒性，能有效地防御活性氧對生物體的毒害作用。

Mn-SOD主要存在于原核細胞和真核細胞的線粒體基質中，呈紫紅色。某些真核生物的葉綠體中也含有一定量的Mn-SOD。真核生物中主要分布于細胞的線粒體內，其基因為單拷貝基因，在人體內位于第6號染色體上，其分子量為80，000道爾頓?(80?kDa)，該酶與Cu,Zn-SOD無同源性。MnSOD?具有抵抗氧化自由基，延緩衰老和抗腫瘤的作用，并與許多氧化損傷引起的疾病有關。

Fe-SOD首次于大腸桿菌中分離得到，Fe-SOD呈黃褐色，主要存在于E.coli和Methanobacterium?bryantii等原核生物及少數高等植物(如油菜、檸檬、銀杏、番茄、水百合等)細胞的葉綠體基質中。Fe-SOD其活性中心的金屬離子與3個His、一個Asp和一個H₂O配位，它的分子結構為二聚體或三聚體，其分子構象主要為α螺旋，與Mn-SOD為同一進化起源。

超氧化物歧化酶是一種用途極廣的藥用酶，在預防和治療氧自由基危害、損傷和抗衰老、抗炎癥、抑制腫瘤和癌癥、治療肌肉萎縮及在免疫系統中治療無菌性炎癥有重要的功能。1992年吳瑞芳介紹了德國格蘭泰有限公司(Grunenthal?GmbH)從動物血液中提取的商品名為潘樂新針(Peroxinorm)的注射用SOD制劑，主要用于治療放射性膀胱炎、類風濕性關節炎。我國自上世紀八十年代以來，對超氧化物歧化酶的應用研究主要側重于動植物SOD的提取和純化，目前市場上的SOD產品大部分是從動物血液中提取的，以豬血為原料提取SOD制劑為多。中國專利CN00113802.2公開了一種牦牛血超氧化物歧化酶及其提取純化工藝和應用。但大多數從動物血液中直接提取的SOD制劑可能對人體有排異性，存在免疫源性的問題。為解決天然SOD免疫源性的問題，美、日、英、德等國相繼開發了人源SOD基因工程產品，已進入到Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究。國內周潮等也對人紅細胞SOD凍干制劑進行了研究。但用人紅細胞生產注射用SOD制劑其原料來源受到極大的限制，并且其療效不一，Jadot等人提出同源SOD不被細胞膜受體辨認而無活性的觀點，所以應對重組人源SOD的研究開發持謹慎態度，注意其應用領域。