[發明專利]牦牛銅鋅超氧化物歧化酶重組表達蛋白質

無效

• 申請號: 201010169323.5
• 申請日: 2010-05-12
• 公開（公告）號: CN101818166A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 徐亞歐;毛德才;毛亮;袁忠;楊德孝;鄭玉才
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N15/53;C12N1/21;C12N9/08;C12R1/19
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 劉雪蓮;劉明芳

1.一種牦牛Cu,Zn-SOD?重組蛋白質純化方法，包括對鑒定正確的重組基因工程菌進行IPTG誘導表達、用負染色法對表達產物進行鑒定、對重組蛋白進行純化及復性，其中：

所述重組基因工程菌IPTG誘導表達方法包括以下步驟：

（1）經鑒定正確的Cu,Zn-SOD-pET22b(+)-E.coli?BL21(DE3)基因工程菌接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃?120rpm震蕩培養過夜，基因工程菌菌液與LB培養基的體積比為1:100；

（2）次日，將過夜培養后的基因工程菌以1:40的體積比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，于37℃震蕩培養；

（3）細菌OD₆₀₀=0.5～1時，加入1mM??IPTG，30℃，誘導表達9小時；

（4）4000r/min離心5min，收集菌體，進行SDS-PAGE電泳，所述SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為15%，積聚膠濃度為5%；

其中，所述Cu,Zn-SOD-pET22b(+)-E.coli?BL21(DE3)基因工程菌是通過將重組載體Cu,Zn-SOD-pET22b(+)轉化到E.coli?BL21(DE3)宿主菌中得到的；

其中，構建所述重組載體Cu,Zn-SOD-pET22b(+)的方法包括以下步驟：

（1）根據奶牛Cu,Zn-SOD?cDNA序列，用DNAsis?for?Windows?Ver?2.5設計一對PCR引物，引物序列如下：

上游引物P1:?5′-CATGCCATGGCGACGAAGGCCGTCTGCGTGC-3′

下游引物P2:?5′-CCCAAGCTTGAATGTTTACTTGGCAATTC-3′

（2）提取牦牛肝臟RNA,以提取的牦牛肝臟RNA為模板，在引物P1和P2的引導下進行逆轉錄PCR擴增；

（3）將RT-PCR產物連接到pGM-T載體，轉化到E.coli?TOP10宿主菌進行克隆，用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒，用雙脫氧鏈終止法對陽性重組質粒中的Cu,Zn-SOD?cDNA測序，將測序結果正確的陽性重組質粒命名為Cu,Zn-SOD-pGM-T質粒；

（4）用限制性內切酶NcoⅠ和HindⅢ對Cu,Zn-SOD-pGM-T質粒和pET22b(+)質粒分別進行雙酶切，分別回收得到Cu,Zn-SOD?cDNA?片段和pET22b(+)開環線狀載體；

（5）將Cu,Zn-SOD?cDNA?片段連接到pET22b(+)開環線狀載體，轉化到E.coli?TOP10宿主菌，用菌液PCR、質粒雙酶切及DNA測序法篩選陽性重組質粒，得到重組載體Cu,Zn-SOD-pET22b(+)；

所述負染色法鑒定表達產物包括以下步驟：

（1）將溶于PBS緩沖液的總蛋白上清液進行10%PAGE電泳，分別用提純的牦牛血液Cu,Zn-SOD和含空載體的細菌細胞上清液作為陽性對照和陰性對照；

（2）電泳結束后取出凝膠條，浸入NBT-TEMED-核黃素體系溶液中避光染色30min，倒出染色液，所述NBT-TEMED-核黃素體系溶液中含有1.5mmol/L?NBT、0.1mmol/L?TEMED、0.12mmol/L核黃素、67mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5；

（3）用pH7.5的PBS沖洗膠片兩次，膠片置于20W日光燈下照射45min，凝膠條無SOD活性部分全部為紫藍色，有SOD活性的部分顯現出無色透明的酶帶，記錄結果數據；

所述重組Cu,?Zn-SOD蛋白質純化方法，包括以下步驟：

（1）經IPTG誘導的表達菌，4℃12000r/min離心15min，收集菌體；

（2）按1g菌體濕重加入10mL?pH7.4的細胞裂解液重懸菌體，洗滌2次，所述細胞裂解液包括20mM??Na₃PO₄、500mM??NaCl；

（3）菌體懸濁液置于冰上超聲破碎20min，破碎5s、間斷9s，4℃12000r/min離心15min，收集沉淀；

（4）按1g菌體濕重加入20mL?pH7.4的包涵體洗滌液Ⅰ重懸沉淀，4℃靜置20min，反復洗滌5次，所述包涵體洗滌液Ⅰ包括20mM??Na₃PO₄、500mM??NaCl、0.1%?TritonX-100；

（5）以同樣的方法用pH7.4的包涵體洗滌液Ⅱ洗滌包涵體5次，4℃12000r/min離心15min，收集沉淀，所述包涵體洗滌液Ⅱ包括20mM??Na₃PO₄、500mM??NaCl、2M??Urea；

（6）按1g菌體濕重加入10mL包涵體變性液向洗滌后的沉淀中加入pH7.4的包涵體變性液，4℃溶解過夜，4℃12000r/min離心30min，收集上清液，經0.45μm濾膜過濾備用，所述包涵體變性液包括20mM??Na₃PO₄，500mM??NaCl，8M?Urea;

所述重組蛋白質復性包括以下步驟：將上述重組Cu,?Zn-SOD蛋白質純化方法步驟（6）純化得到的包涵體蛋白用尿素濃度梯度法4℃透析復性，透析緩沖液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M尿素的PBS緩沖液，最后以無尿素的PBS緩沖液4℃透析過夜。