[發明專利]制備5’-磷酸二酯酶的方法及用其制備2’-脫氧核苷酸的方法

有效

• 申請號: 201010169002.5
• 申請日: 2010-05-07
• 公開（公告）號: CN101845422A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 丁慶豹;歐伶;魏曉琨;許彥梅;王玥
• 申請（專利權）人: 上海斯貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12P19/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種從麥芽根中制備高活力液體5’-磷酸二酯酶的方法，以及應用該酶降解脫氧核糖核酸制備高純度2’-脫氧核苷酸的方法。

背景技術

2’-脫氧核苷酸為組成遺傳物質脫氧核糖核酸(DNA)的重要組成部分，參與細胞內大量的生化反應。臨床上，2’-脫氧核苷酸的混合鈉鹽可制備為針劑或口服劑，用于輔助治療免疫低下的患者。近年來隨著分子生物學的高速發展，尤其是現代基因工程技術中大量使用脫氧核苷三磷酸作為PCR的基礎試劑，作為合成脫氧核苷三磷酸的原料-2’-脫氧核苷酸的市場需求日益增加。

目前，2’-脫氧核苷酸的制備主要由酶法降解DNA中獲得，其工藝大體如下：1)利用市售的5’-磷酸二酯酶或桔青霉發酵產生的核酸酶P1，降解由魚白中提取的DNA，獲得酶解液，即2’-脫氧腺苷酸(dAMP)、2’-脫氧胞苷酸(dCMP)，2’-脫氧鳥苷酸(dGMP)和胸苷酸(TMP)的混合物；2)經活性炭脫鹽、脫蛋白進行純化；3)濃縮干燥后得到混合2’-脫氧核苷酸的固體。

上述工藝對于制備混合2’-脫氧核苷酸具有一定的意義，但是對于應用到分子生物學試劑卻沒有實際作用。因為分子生物學試劑需要極高的純度(HPLC純度至少要達到98％以上)，以滿足后期的試驗需要。

有關從麥芽根中提取5’-磷酸二酯酶用于降解核糖核酸(RNA)制備核苷酸已有不少報道，如中國專利公開號CN101012469A提供了一種采用液體5’-磷酸二酯酶制備5’-核苷酸類物質的方法；李德瑩等報道了從麥芽根中提取5’-磷酸二酯酶降解生產5’-核苷酸的方法(華東理工大學學報，2002，28(4)：376-379)。這些報道中均未提及脫氧核糖核酸的酶解。

有關從核糖核酸的降解液中提取核苷酸的方法也很多。如中國專利公開號CN1286259公開了一種使用陽離子樹脂分離5’-核苷酸的方法；中國專利ZL02136839.2公開了一種使用陰離子樹脂分離5’-核苷酸的方法；中國專利公開號CN101381382A中提供了一種使用陰離子樹脂分離2’-脫氧核苷酸的方法。上述方法中大多是以分離5’-核苷酸為目的，或以制備混合2’-脫氧核苷酸為目的。

Makoto等使用桔青霉發酵得到的核酸酶P1，大約有47％的DNA降解為2’-脫氧核苷酸(Food?research?International，1996，29(8)∶751-755)；吳漢民等亦以同樣的方法降解DNA，并用陰離子交換樹脂分離法分離得到了2’-脫氧核苷酸，報道中未提到轉化率及2’-脫氧核苷酸的收率(水產學報，2000，24(3)：275-279)。

上述專利和文獻中所述及的方法，2’-脫氧核苷酸的轉化率低、或分離工藝效率低下、或未涉及高純度2’-脫氧核苷酸的制備。

發明內容

本發明的發明人經過廣泛的探索，發明了一種從麥芽根中制備高活力液體5’-磷酸二酯酶的方法。然后發明了應用該酶降解脫氧核糖核酸制備2’-脫氧核苷酸的方法。

因此，本發明所要解決的技術問題之一是提供一種從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法。

本發明所要解決的技術問題之二是提供一種用從麥芽根中制備的5’-磷酸二酯酶降解DNA生產2’-脫氧核苷酸，并從酶解液中分離得到高純度的2’-脫氧核苷酸的方法，以解決現有技術中存在的2’-脫氧核苷酸的轉化率低、或分離工藝效率低下、或未涉及高純度2’-脫氧核苷酸的制備之類的技術缺陷。

本發明的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法包括如下步驟，(1)浸泡：將粉碎或未粉碎的麥芽根與去離子水混合、浸泡，浸泡溫度10-50℃、浸泡時間1-8小時；(2)固液分離：浸泡結束后，過濾或離心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有機溶劑，并攪拌1-8小時，于1000-10000轉/min離心去除殘渣，收集離心液；(4)向離心液中加入0.5-20倍離心液體積的有機溶劑，于室溫下靜置1-24h后，虹吸去除上層的液體，下層的液體攪勻即為高純度液體5’-磷酸二酯酶。

優選的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其中浸泡溫度40-45℃，浸泡時間為3-5小時。

更優選的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法其中步驟(1)去離子水用量為麥芽根重量的7-8倍。

所用麥芽根為大麥或燕麥發芽后的根，也可以為各種植物的根尖部分。優選為啤酒工業中廢棄的麥芽根。麥芽根可浸泡后再進行粉碎，也可以粉碎后再浸泡。本發明優選粉碎后再浸泡，粉碎的粒度可在50-400目之間，優選為250目-350目。