[發明專利]制備5’-磷酸二酯酶的方法及用其制備2’-脫氧核苷酸的方法

有效

• 申請號: 201010169002.5
• 申請日: 2010-05-07
• 公開（公告）號: CN101845422A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 丁慶豹;歐伶;魏曉琨;許彥梅;王玥
• 申請（專利權）人: 上海斯貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12P19/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于包括如下步驟，(1)浸泡：將粉碎或未粉碎的麥芽根與去離子水混合、浸泡，浸泡溫度10-50℃、浸泡時間1-8小時；(2)固液分離：浸泡結束后，過濾或離心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有機溶劑，并攪拌1-8小時，于1000-10000轉/min離心去除殘渣，收集離心液；(4)向離心液中加入0.5-20倍離心液體積的有機溶劑，于室溫下靜置1-24h后，虹吸去除上層的液體，下層的液體攪勻即為高純度液體5’-磷酸二酯酶。

2.根據權利要求1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步驟(1)的，加入的酶活為500U-3000U/g?DNA，優選為1000U-2500U/g?DNA，攪勻后于60-65℃反應1-24h得酶反應液，(3)2’-脫氧核苷酸的分離純化：上述酶反應液2.0L用氫氧化鈉調pH至8.0左右，通過裝有250mL的陰離子交換樹脂的玻璃柱(Φ2.6cm×70cm)，流速控制在100-200mL/h，上樣結束后，依次用下列溶液進行洗滌或洗脫：2500mL氫氧化鈉溶液(pH＝8.0)、1500mL?0.01mo浸泡溫度40-45℃，浸泡時間為3-5小時。

3.根據權利要求1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步驟(1)去離子水用量為麥芽根重量的7-8倍。

4.根據權利要求1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步驟(3)和(4)的有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氫呋喃、二甲基亞砜。

5.制備2’-脫氧核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步驟，(1)根據權利要求1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA：配制0.5％-5％(W/V)DNA溶液，加熱到25-75℃，然后加入上述制備的5’-磷酸二酯酶1/L甲酸(I)、1500mL?0.15mol/L甲酸(II)、2000mL?0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸鈉(III)、2000mL?0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化鈉(IV)，將I-IV洗脫下來的四種2’-脫氧核苷酸溶液用氫氧化鈉調pH8.0-pH10.0，分別用100mL的陰離子交換樹脂進行吸附(Φ1.6cm×70cm)，流速控制在50-100mL/h，上樣結束后，用100mL去離子水洗滌樹脂柱，棄去洗滌液，最后用150mL?0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化鈉(V)分別從四根柱上洗脫下來2’-脫氧核苷酸，收集洗脫液，濃縮至10-50mL，加入3-10倍體積的乙醇沉淀出2’-脫氧核苷酸，經過濾、抽干、烘干，分別得到2’-脫氧胞苷酸、2’-脫氧腺苷酸、胸苷酸二鈉、2’-脫氧鳥苷酸二鈉。

6.根據權利要求5的制備2’-脫氧核苷酸的方法，其特征在于，步驟(2)酶解DNA：配制1％-3％(W/V)DNA溶液，加熱到60-65℃，然后加入上述制備的5’-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活為1000U-2500U/g?DNA，攪勻后于60-65℃反應7-10h得酶反應液。