[發(fā)明專利]小鼠IL-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010167604.7
• 申請(qǐng)日: 2010-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN101831435A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉海燕;胡博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉海燕
• 主分類號(hào): C12N15/24
• 分類號(hào): C12N15/24;C12N15/70;C07K14/54;A61K38/20;A61P37/02;A61P31/16;A61P11/00;A61P19/02;A61P19/04;A61P29/00;A61P1/00;A61P17/06;A61P1/16
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種小鼠單抗蛋白的制備，特別涉及一種小鼠IL-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

IL-15mRNA(interleukin?15，IL-15)廣泛表達(dá)于各種組織中，包括胎盤、骨骼肌、腎臟、心臟、肺、腦、腸上皮，并同樣表達(dá)于髓系的造血干細(xì)胞中比如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。IL-15在結(jié)構(gòu)上與白細(xì)胞介素2(interleukin?2，IL-2)有同源性，IL-15受體由具有高親和力的IL-15受體a鏈、IL-2/15受體β鏈以及公共鏈γ鏈組成，因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T細(xì)胞活化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性并促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-15在NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞的分化、增殖、活化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，IL-15與IL-17對(duì)CD8記憶性T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)非常重要。研究還證明IL-15通過(guò)一種特殊的“反遞呈”機(jī)制來(lái)調(diào)控CD8記憶性T細(xì)胞的增殖和NK細(xì)胞的生存周期，即一種表達(dá)IL-15a鏈?zhǔn)荏w的細(xì)胞能夠?qū)L-15遞呈給表達(dá)IL-15β鏈和γ鏈的細(xì)胞。更多的研究表明IL-15是一種有廣泛生物學(xué)功能的功能強(qiáng)大的細(xì)胞因子，除了對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，在非免疫系統(tǒng)中也同樣重要，比如對(duì)骨骼肌合成代謝也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

由于IL-15具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，并對(duì)多種器官具有潛在的調(diào)節(jié)作用，因此其在體內(nèi)的表達(dá)在多個(gè)水平受到嚴(yán)格控制。人和小鼠的IL-15基因5′調(diào)控區(qū)均包含干擾素反應(yīng)因子元件(IRF-E)及NF-κB結(jié)合位點(diǎn)用于上調(diào)IL-15mRNA的表達(dá)。IL-15基因的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，IL-15mRNA的5′UTR區(qū)域存在的多個(gè)起始密碼子(小鼠為5個(gè)AUGs，人類為12個(gè)AUGs)阻礙了IL-15蛋白的有效翻譯，IL-15mRNA的3′UTR區(qū)域的調(diào)控序列同樣能阻止IL-15蛋白的分泌。選擇性剪切也同樣參與了對(duì)IL-15基因表達(dá)的調(diào)控。

早期研究發(fā)現(xiàn)的三種IL-15亞型編碼相同的成熟蛋白，但是其信號(hào)肽之間存在區(qū)別：由48aa組成的長(zhǎng)信號(hào)肽(LSP)從3號(hào)外顯子中編碼區(qū)內(nèi)的真正的起始密碼子開始表達(dá)，而短信號(hào)肽(SSP，小鼠為26aa，人類為21aa)則由一個(gè)新產(chǎn)生的5號(hào)外顯子中的起始密碼子開始表達(dá)終止于非成熟的終止密碼子。這些不同的信號(hào)肽將IL-15蛋白運(yùn)輸至胞外不同的位置。短信號(hào)肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率很高，但是很難分泌；而長(zhǎng)信號(hào)肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率較低，但是能直接被運(yùn)輸至高爾基體并分泌。由于IL-15主要通過(guò)IL-15Ra的反式遞呈發(fā)揮功能，共調(diào)節(jié)IL-15及IL-15R有可能會(huì)促使IL-15產(chǎn)生多種功能活性。近期于小鼠小腸上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的兩種新的IL-15亞型，與正常的IL-15mRNA相比，分別缺少6號(hào)外顯子及7號(hào)外顯子的一部分，直接導(dǎo)致其編碼的成熟蛋白與正常IL-15蛋白有區(qū)別，研究證明其信號(hào)肽均為L(zhǎng)SP。這兩種編碼成熟蛋白改變的IL-15亞型提示IL15/IL-15-R體系比目前所已知的可能更為復(fù)雜。

關(guān)于小鼠IL-15亞型蛋白的制備及應(yīng)用，經(jīng)查新國(guó)外僅有美國(guó)康涅狄格州健康中心X?Tan和L?Lefranc，ois在小腸上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名該亞型為ΔE6IL-15。小鼠小腸上皮細(xì)胞中該亞型是在免疫體系處于常態(tài)下發(fā)現(xiàn)的，而未見(jiàn)在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備IL-15亞型蛋白的報(bào)道。本發(fā)明首次于小鼠脾細(xì)胞處于免疫激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)該種亞型，提示該種亞型蛋白可能在免疫體系的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的

本發(fā)明目的為制備在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備IL-15亞型蛋白，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)正常IL-15蛋白的拮抗作用，提供該亞型蛋白在自身免疫性疾病等臨床治療中的應(yīng)用。

技術(shù)方案

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，制備有功能活性的小鼠IL-15亞型蛋白，其制備方法包括以下步驟：

(1)擴(kuò)增IL-15亞型基因片段：取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，使用0.1μg/ml-100μg/m?LPS作用24h-48h刺激小鼠脾細(xì)胞，獲得刺激后的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液，通過(guò)Trizol-氯仿法抽提總RNA。根據(jù)NCBI所公布小鼠IL-15cDNA序列(NM008357.1)及pET43.1原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異性引物，見(jiàn)Seq?NO.1和SeqNO.2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR常規(guī)操作擴(kuò)增獲得小鼠IL-15目的片段。