[發明專利]小鼠IL-15亞型蛋白的制備及其應用

有效

• 申請號: 201010167604.7
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101831435A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 劉海燕;胡博
• 申請（專利權）人: 劉海燕
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/70;C07K14/54;A61K38/20;A61P37/02;A61P31/16;A61P11/00;A61P19/02;A61P19/04;A61P29/00;A61P1/00;A61P17/06;A61P1/16
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.一種小鼠IL-15亞型融合蛋白的制備方法，其特征包括以下步驟：

(1)擴增小鼠IL-15亞型基因片段：取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，使用0.1μg/ml-100μg/m?LPS作用24h-48h刺激小鼠脾細胞，獲得刺激后的C57BL/6小鼠脾細胞懸液，通過Trizol-氯仿法抽提總RNA；根據NCBI所公布小鼠IL-15?cDNA序列NM008357.1及pET43.1原核表達載體的結構設計特異性引物Seq?NO.1和SeqNO.2，經逆轉錄-PCR操作擴增獲得小鼠IL-15目的片段；

(2)獲取小鼠IL-15亞型基因克隆：取步驟1所得PCR產物，按照凝膠回收試劑盒說明回收IL-15基因亞型片段；將回收所得PCR產物與PGEM-T克隆載體連接、4℃連接過夜；取連接產物轉化至DH10B的感受態細菌，挑菌并酶切鑒定獲得陽性質粒；取該質粒進一步測序鑒定其基因序列Seq?NO.3；

(3)構建重組小鼠IL-15的pET43.1原核表達載體：取測序鑒定正確的步驟2所得質粒及原核表達載體pET43.1，分別進行SacI、XhoI內切酶雙酶切并按照凝膠回收試劑盒說明書回收酶切所得片段；將回收所得酶切片段連接過夜，取連接產物轉化感受態DH10B菌，挑菌，按照質粒小抽試劑盒說明抽提質粒酶切鑒定；

(4)pET43.1-IL-15亞型基因轉化菌的表達：取鑒定正確的步驟3中重組質粒轉化感受態細胞BL21(DE3)，挑取單菌落，抽提質粒，酶切鑒定，篩選正確轉化的表達菌pET43.1-IL-15/BL21；

(5)純化并獲得無標簽的小鼠IL-15亞型蛋白Seq?NO.4。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的pET43.1-IL-15亞型基因轉化菌的表達進行自發表達，即從以上BL-21轉化菌平板上挑取菌落，在含AMP(75μg/ml)MDG非表達培養基中37℃培養，過夜，至菌液密度達到飽和，吸取1ml菌液至100ml的含AMP(75μg/ml)ZYM5052表達培養基中37℃培養過夜，其中所述的

MDG非表達培養基(10ml)?????ZYM-5052表達培養基(10ml)

9.15ml?H₂O????????????????9.58ml?ZY

20μl?1M?MgSO₄????????????20μl?1M?MgSO₄

2μl?1000×metals?????????2μl?1000×metals

125μl?40％glucose????????200μl?50×5052

500μl?5％aspartate???????200μl?50×M

200μl?50×M。

3.一種小鼠IL-15亞型蛋白在制備自身免疫性疾病藥物的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為類風濕性關節炎、多發性硬化、強直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎、逆轉錄病毒HTLV-1相關疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管炎、克隆病、腸炎或雷諾氏病。

5.一種小鼠IL-15亞型蛋白在制備用于流感所致的急性肺炎治療藥物的應用。