[發(fā)明專利]一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010166710.3
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN102242103A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛百忠;李小軍;王宏英;薛雁;李秀林;丁忠福;薄學(xué)軍
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧諾康醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制備方法。

背景技術(shù)

自1936年Klobusitzki和Konig首次從美洲矛頭蝮蛇(Bothrops?jararaca)毒中純化出類凝血酶以來，迄今已發(fā)現(xiàn)40余種蛇毒中含有類凝血酶組分，有的已被分離和純化。其中有幾種已被制成商品出售，用做臨床藥物研究和實(shí)驗(yàn)試劑。其中獲得了9種類凝血酶的全序列。過去幾年中，各國科研工作者進(jìn)行了包括分子克隆在內(nèi)的大量的研究。通過這些研究，已經(jīng)清楚認(rèn)識了30余種類凝血酶的一級結(jié)構(gòu)。這些類凝血酶都有相同的保守的活性中心(His57，Asp102，Ser195)。特別是Vieiral在2004年從Bofhrops?jararaca中分離出了Jaraxassin-I，并得到了其晶體，這對進(jìn)一步了解類凝血酶的結(jié)構(gòu)非常有幫助。

蛇毒類凝血酶分布最廣的是蝮亞科蛇毒。目前，已從蝮甄科二十多種蛇毒中找到蛇毒類凝血酶。其中有近十種蛇毒的TLE已被分離純化，包括響尾蛇屬二種、蝮屬三種、矛頭蝮屬三種及烙鐵頭屬二種。蛇毒類凝血酶制劑Ancrod、Reptilases和Batroxobin，都是從矛頭蝮屬的蛇毒中分離純化的。我國毒蛇蛇毒中含有類凝血酶者有尖吻蝮蛇、竹葉青、長自山白眉蝮蛇等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是充分利用藥源并提供一種產(chǎn)率高、組分純、藥效高的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制備方法。

本發(fā)明所述的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的制備步驟為：

(1)、尖吻蝮蛇蛇毒用緩沖液浸泡、溶解過夜，離心去除沉淀，得上清液；

(2)、蛇毒上清液經(jīng)DEAE-Sephadex?A-50離子交換層析，上樣結(jié)束后，用pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數(shù)達(dá)到基線后，再用pH7.5含0～0.1M?NaCL的Tris-HCl緩沖溶液梯度洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集活性峰，目的類凝血酶為第4峰；

(3)、第4峰用pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液透析；

(4)、透析后樣品經(jīng)Q-Sepharos離子交換層析，上樣結(jié)束后，用pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數(shù)達(dá)到基線后，再用pH8.0含0～0.1M?NaCL的Tris-HCl緩沖溶液梯度洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集活性峰，目的類凝血酶為第3峰；

(5)、第3峰用pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液透析；

(6)、透析后樣品經(jīng)陰離子葡聚糖凝膠層析，上樣結(jié)束后，用pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數(shù)達(dá)到基線后，再用pH7.5含0～0.1M?NaCL的Tris-HCl緩沖溶液梯度洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集掛柱峰，得到單一成份的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。

上述提取分離的全過程均在常溫下進(jìn)行操作。

本發(fā)明所述步驟(1)中的緩沖溶液是pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

本發(fā)明所述步驟(2)中DEAE-Sephadex?A-50離子交換層析柱所選擇的流速為3.0mL/min。

本發(fā)明所述步驟(3)中第4峰需用pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液透析至少三次，使類凝血酶粗提液接近pH8.0。

本發(fā)明所述步驟(4)中Q-Sepharos離子交換層析柱所選擇的流速為2.0mL/min。

本發(fā)明所述步驟(5)中第3峰需用pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液透析至少三次，使類凝血酶粗提液接近pH7.5。

本發(fā)明所述步驟(6)中陰離子葡聚糖凝膠層析柱所選擇的流速為2.0mL/min。

本發(fā)明的方法是以DEAE-Sephadex?A-50離子交換層析、Q-Sepharos離子交換層析和陰離子葡聚糖凝膠層析進(jìn)行單一成份的類凝血酶的制備方法。本發(fā)明可以在常溫下進(jìn)行操作，并具有工藝穩(wěn)定、適合規(guī)模化生產(chǎn)、操作簡單、產(chǎn)率高、產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1：尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶生產(chǎn)工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例所述從尖吻蝮蛇蛇毒中提取類凝血酶的步驟為：