[發(fā)明專利]一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010166530.5
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101845095A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張許科;孫進忠;喬榮岑;陶家權(quán);郭麗霞;張海洋;習向鋒;李三
• 申請（專利權(quán)）人: 洛陽普萊柯生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法。

背景技術(shù)

豬傳染性胃腸炎，豬流行性腹瀉是目前證實的引起豬發(fā)生腹瀉的重要的兩個病毒性傳染性病。這兩種疾病主要對仔豬的影響較大，是引起仔豬死亡的主要病毒性腹瀉病。這兩種病常常混合感染，在流行病學、臨床癥狀、病理解剖學變化上都非常相似，很難區(qū)別到底是哪一種病毒感染，而且發(fā)病急速，在發(fā)病后近幾個小時就可波及全群，主要是造成哺乳期仔豬的大批死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。

豬傳染性胃腸炎(Porcine?Transmissible?Gastroenteritis，TGE)是由冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine?Transmissible?Gastroenteritis?virus，TGEV)引起的以豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的傳染病，對新生仔豬具有高度致死率，通常為100％。雖然不同年齡的豬對這種病毒均易感，但5周齡以上的豬感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美國首次報道了這一疾病以后，世界上許多國家都相繼報道了豬傳染性胃腸炎。我國從1956年在廣東省首次發(fā)生這種疾病后，全國大多數(shù)省份也有豬傳染性胃腸炎的發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重危害。

豬流行性腹瀉(Porcine?Epidemic?Diarrhae，PED)是冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬流行性腹瀉病毒(Porcine?Epidemic?Diarrhae?virus，PEDV)引起的一種豬腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。各種年齡的豬均易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達100％，尤其哺乳仔豬受害最為嚴重。豬流行性腹瀉主要發(fā)生在冬季和早春天氣較為寒冷的季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。上世紀70年代初期許多國家相繼報道了豬流行性腹瀉的發(fā)生，我國上世紀80年代開始陸續(xù)有發(fā)生豬流行性腹瀉的報道。

目前主要用疫苗免疫母豬來預防這兩種疾病的發(fā)生。由于還沒有針對病毒性疾病的特效藥物，因此在臨床治療上主要采取對癥治療和用抗生素類藥物預防并發(fā)癥的發(fā)生，其治療效果不理想。此外，由于這兩種疾病發(fā)病急速，出現(xiàn)腹瀉后，仔豬大多由于腹瀉而脫水，很快就會衰竭而死亡。因此，在生產(chǎn)中急需一種既具有特異性，療效又確實，治療效果迅速顯現(xiàn)的治療制劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法。

本發(fā)明的免疫原采用細胞培養(yǎng)物加油佐劑乳化制備而成，其中豬傳染性胃腸炎病毒用豬腎細胞(PK15)傳代細胞培養(yǎng)；豬流行性腹瀉病毒用非洲綠猴腎細胞(Vero)傳代細胞進行培養(yǎng)；這兩種病毒的病毒含量都≥10^6.0TCID₅₀/ml，將這兩種病毒以體積比(1～3)∶(1～3)的比例混合后與油佐劑以1∶2體積比乳化后作為免疫原，免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，收集蛋黃進行蛋黃抗體效價檢測，選擇高效價的蛋黃提純蛋黃抗體。該抗體經(jīng)口服后直接作用于仔豬腸道，以治療和預防傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和流行性腹瀉病毒(PEDV)感染。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下列技術(shù)步驟：

一、TGEV抗原的制備

將傳染性胃腸炎病毒液接種在PK15單層細胞上，同時設(shè)立細胞對照，37℃?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細胞病變，至75％細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，凍融，離心分離，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮后用作抗原。

二、PEDV抗原的制備

將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同時設(shè)立細胞對照，37℃?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后于離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75％細胞出現(xiàn)細胞病變時，收獲細胞懸液，凍融后于離心分離，收集上清液，濃縮后用作抗原。

三、蛋黃抗體的制備

1.動物免疫