[發(fā)明專利]一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010166530.5
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN101845095A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 張許科;孫進忠;喬榮岑;陶家權;郭麗霞;張海洋;習向鋒;李三
• 申請（專利權）人: 洛陽普萊柯生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

1.一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，豬傳染性胃腸炎病毒用豬腎細胞傳代細胞培養(yǎng)，豬流行性腹瀉病毒用非洲綠猴腎細胞傳代細胞進行培養(yǎng)，將這兩種病毒以體積比(1～3)∶(1～3)的比例混合后與油佐劑以1∶2體積比乳化后作為免疫原，免疫非免疫產蛋雞，從其蛋黃中提取豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒蛋黃抗體。

2.根據(jù)權利要求1所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)TGEV抗原的制備

將傳染性胃腸炎病毒液接種在PK15單層細胞上，同時設立細胞對照，37℃?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細胞病變，至75％細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，凍融，離心分離，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮后用作抗原；

(2)PEDV抗原的制備

將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同時設立細胞對照，37℃?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75％細胞出現(xiàn)細胞病變時，收獲細胞懸液，凍融后離心分離，收集上清液，濃縮后用作抗原；

(3)蛋黃抗體的制備

將TGEV和PEDV抗原以1∶1的比例混合，滅活24h后，作為首免用免疫原；取適量的TGEV和PEDV抗原以1∶1的比例混合，滅活24h后，與2倍量的油佐劑乳化，作為二免、三免和四免用免疫原；用上述制備的免疫原對非免疫產蛋雞進行免疫，另設不免疫的空白對照組；二免后1周開始每隔3天抽樣測定高免雞蛋蛋黃中抗TGEV、PEDV特異抗體效價；若抗體效價達到1∶8以上即可集蛋，收集蛋黃；充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，滅活；然后先在隔層反應罐中加入相當于原蛋黃6倍體積的pH值為4.2的滅菌蒸餾水，并降溫至1～4℃，然后將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4～8℃靜置4h；離心分離上清液并轉入另一反應罐中，按總量的0.2％加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置2～4h；用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清，按總量的0.1％加入飽和甲醛水溶液于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫放置24h，期間振搖數(shù)次，過濾除菌，用截留分子量為1000KDa的超濾膜過濾除病毒，得到提純的蛋黃抗體，即TGEV、PEDV二聯(lián)蛋黃抗體；

(4)將提純的蛋黃抗體液凍干貯存

3.根據(jù)權利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于所用豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的病毒含量都≥10^6.0TCID₅₀/ml。

4.根據(jù)權利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于TGEV抗原的制備程序是：將傳染性胃腸炎病毒液接種3瓶PK15細胞，瓶底面積25cm²，每瓶細胞接種1ml病毒液，蓋好瓶蓋，橫臥瓶管輕輕轉動，使病毒液與整個細胞單層充分接觸，37℃吸附40min，其間每隔10min晃動1次，無需吸棄病毒液，直接加含2％胎牛血清的DMEM細胞維持培養(yǎng)液5ml，同時設立細胞對照，37℃?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變(CPE)不明顯，則收獲細胞懸液-20℃～20℃反復凍融3次后在4℃條件下3000rpm離心30min取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細胞病變，至75％細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，-20℃～20℃反復凍融3次，然后在4℃條件下，3000rpm離心30min，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮后用作抗原。