[發(fā)明專利]改造的角化細(xì)胞生長因子基因及其在酵母中的表達(dá)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010166361.5
• 申請日: 2010-05-10
• 公開（公告）號: CN102242124A
• 公開（公告）日: 2011-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王晶翼;李劍鳳;艾麗靜;王希菊;劉克玲;宮新江;王慶民;孫麗霞
• 申請（專利權(quán)）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N1/19;A61K38/18;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種角化細(xì)胞生長因子表達(dá)基因及其表達(dá)與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

角化細(xì)胞生長因子(Keratinocyte?growth?factor，KGF)屬于成纖維細(xì)胞生長因子家族(fibroblast?growth?factor，F(xiàn)GF)，又稱FGF7。KGF是在1989年，由Rubin從胚胎肺成纖維細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)液中經(jīng)超濾、親和層析和反相高壓液相(RP-HPLC)分離并純化得到的，該分子具有很強(qiáng)的肝素親和性，與其它成纖維細(xì)胞生長因子可影響幾乎所有中胚層起源的細(xì)胞生長的特點(diǎn)不同，KGF的活性主要限于上皮細(xì)胞，具有特異性地促進(jìn)上皮細(xì)胞尤其是角化細(xì)胞有絲分裂的作用，因此命名為角化細(xì)胞生長因子。

KGF的表達(dá)僅限于間質(zhì)細(xì)胞，而它的受體則是在上皮細(xì)胞中表達(dá)，它的生物學(xué)活性是作用于上皮細(xì)胞，承擔(dān)間質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞間的信號傳遞功能。對于依賴間充質(zhì)細(xì)胞-上皮細(xì)胞相互作用的器官、組織，如皮膚、呼吸道、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)等，在它們的間質(zhì)細(xì)胞中均能檢測到KGF?mRNA的表達(dá)，而在對應(yīng)的上皮細(xì)胞中能檢測到KGF受體的mRNA。KGF的生物學(xué)作用是通過與其靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合完成的，發(fā)揮的生物學(xué)活性包括：促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、在發(fā)育中的作用、在損傷修復(fù)中的作用，另有研究表明KGF與癌癥的發(fā)生有密切的關(guān)系。

完整的KGF蛋白質(zhì)具有194個(gè)氨基酸(包括前端信號肽序列)，肽中含有5個(gè)半胱氨酸，其中4個(gè)半胱氨酸形成2對二硫鍵，另一個(gè)半胱氨酸折疊在蛋白質(zhì)中。成熟KGF為163個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，蛋白質(zhì)的氨基端有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，其表觀分子量約為26～28KD。1993年，Dina等構(gòu)建了一些KGF突變體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，純化出相關(guān)蛋白后用以研究蛋白與細(xì)胞表面受體的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肽鏈的前23個(gè)氨基酸的缺失提高了KGF的促有絲分裂活性和熱穩(wěn)定性，這對后來KGF藥用蛋白的開發(fā)起到了積極的作用。

美國Amgen公司開發(fā)了在大腸桿菌中表達(dá)N末端缺失23個(gè)氨基酸的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子突變體Palifermin(Kepivance^TM)，主要用于治療放、化療引起的口腔粘膜炎。臨床試驗(yàn)證明，Kepivance^TM在治療骨髓移植癌癥患者口腔粘膜炎方面取得了很好的療效，且副作用小。目前該產(chǎn)品正在進(jìn)行用于治療頭頸癌、血癌、結(jié)腸直腸癌患者放化療后的口腔粘膜炎的研究，2005年1月美國FDA批準(zhǔn)該藥用于治療惡性腫瘤患者接受有骨髓毒性的治療引起的口腔粘膜炎，并授予其為罕見藥資格。

目前批準(zhǔn)上市的KGF由大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)，大腸桿菌生產(chǎn)的蛋白存在變、復(fù)性的困難；石磊等在文獻(xiàn)“重組人KGF的cDNA克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)”公開了利用畢赤酵母異源表達(dá)KGF，但均因表達(dá)量過低而無法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的可在畢赤酵母中高效表達(dá)的角化細(xì)胞生長因子表達(dá)基因及其構(gòu)建的載體與應(yīng)用。

本發(fā)明涉及：

[1]一種編碼角化細(xì)胞生長因子的基因片段，它具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明角化細(xì)胞生長因子的基因片段是通過主要是通過如下改造獲得的：(a)刪去角化細(xì)胞生長因子基因5’端69個(gè)核苷酸；(b)在不改變氨基酸序列的基礎(chǔ)上按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化；(c)全基因合成角化細(xì)胞生長因子序列。

另外，本發(fā)明涉及：

[2]一種含有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列的表達(dá)載體。

此外，本發(fā)明涉及：

[3]一種畢赤酵母，該畢赤酵母含有[2]中所述的表達(dá)載體。

并且，本發(fā)明涉及：

[4]一種[3]中畢赤酵母的構(gòu)建方法，該方法包括：(1)利用XhoI和EcoRI雙酶切合成的角化細(xì)胞生長因子，構(gòu)建重組質(zhì)粒X-KGF；(2)轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性平板篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子；(3)利用搖瓶發(fā)酵對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步篩選；

所述步驟(1)中的重組質(zhì)粒X-KGF，X代表選擇的表達(dá)質(zhì)粒。

[5]根據(jù)[4]記載的畢赤酵母的構(gòu)建方法，步驟(1)所述構(gòu)建重組質(zhì)粒X-KGF是指利用核酸限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI雙酶切合成的角化細(xì)胞生長因子，克隆到相同酶切的表達(dá)質(zhì)粒X上，然后進(jìn)行測序驗(yàn)證。