[發(fā)明專利]基于聚合物微球變化的編碼檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010165666.4
• 申請日: 2010-05-07
• 公開（公告）號: CN101846672A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 常津;李云紅;張琦;宋濤;逯超亮
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/533;G01N33/576;G01N33/569;G01N33/571;G01N33/68;C12Q1/68
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)用檢測技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種基于聚合物微球變化的編碼檢測方法。本發(fā)明是建立在免疫反應(yīng)以及基因雜交特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，對編碼技術(shù)的創(chuàng)新，可同時實(shí)現(xiàn)多個待測樣本或指標(biāo)的檢測，簡單、快速、可靠。

背景技術(shù)

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，人們對生命現(xiàn)象的觀察和研究已經(jīng)深入到單細(xì)胞、單分子水平。生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段和實(shí)驗(yàn)工具，尤其是對感染性疾病、遺傳性疾病和惡性腫瘤等的臨床診斷具有極其重要的作用。

流式細(xì)胞術(shù)(Flow?Cytometry，F(xiàn)CM)是一種在功能水平上對細(xì)胞或其他生物粒子定量檢測和分選的分析方法，在生物床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。細(xì)胞或粒子在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩種光信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管(PMT)接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測，稱為前向散射(forward?scatter，F(xiàn)SC)，這種信號反映了微球粒徑或體積的大小；90°散射光又稱側(cè)向散射(side?scatter，SSC)，是指與激光束-液流平面垂直的散射光，其信號強(qiáng)度可反映微球內(nèi)部復(fù)雜程度。檢測后的信號經(jīng)計算機(jī)處理后即轉(zhuǎn)化為可直觀觀察的一維直方圖或二維散點(diǎn)圖。流式細(xì)胞儀的分辨率主要取決于儀器本身，常用變異系數(shù)(Cv)來表示，Cv＝d/m×100％(d是分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m是分布的平均值)。近年來，流式細(xì)胞儀在技術(shù)原理和設(shè)計研制方面無突破性進(jìn)展，但在各種功能上卻有了很大提高，尤其是熒光探針的不斷推陳出新，使流式細(xì)胞儀新的參量分析方面不斷有新的發(fā)展，并使儀器不斷向小型化，操作自動化、簡單化方向發(fā)展。顧忠澤等(CNl595149A)發(fā)明一種基于編碼微球的微流控生物芯片，是基于流式細(xì)胞術(shù)原理發(fā)展的一種新的檢測技術(shù)。

編碼技術(shù)是目前用于醫(yī)學(xué)檢測以及科學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，是將待檢測的信息轉(zhuǎn)換為微球顏色、粒徑或者磁性等能快速、準(zhǔn)確檢測的信號，便于判斷和篩選。Chandler等(美國專利，US626822)利用聚苯乙烯納米微球，溶脹吸附熒光物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了編碼。顏曉梅等(CN101392172A)制得了粒徑均一的、羧基化熒光編碼微球。蘇星光等(CN101530766A)發(fā)明了磁性熒光編碼微球，集磁響應(yīng)與熒光編碼于一身，在應(yīng)用方面具有很大優(yōu)勢。但是由于熒光物質(zhì)本身發(fā)光效率和穩(wěn)定性難控制、不同波長熒光效率差別顯著等引發(fā)的問題仍然存在。目前應(yīng)用較多微球聚合方法主要包括分散聚合、懸浮聚合、乳液聚合、種子聚合、SPG膜乳化法等。20世紀(jì)八十年代Ugelstad等開發(fā)了種子溶脹聚合法，通過引入惰性溶劑和單體一起溶脹單分散種子微球，可以用來制備單分散的聚合物微球。目前對種子溶脹聚合的理論和方法已經(jīng)相當(dāng)成熟，通過二步種子溶脹聚合可以獲得不同系列粒徑、高度均勻的功能化微球，不僅可以獲得高交聯(lián)度的致密微球，還能獲得介孔或微孔球。由于微球表面帶有功能基團(tuán)，特別是羧基基團(tuán)，可以與抗體、抗原以及基因片段結(jié)合成為診斷微球。診斷微球基于免疫反應(yīng)或基因雜交特異性反應(yīng)，特異地識別待測物質(zhì)，通過流式細(xì)胞儀檢測即可準(zhǔn)確判斷樣品中是否含有該物質(zhì)或診斷患者是否患有某種疾病。

目前很多液相生物芯片的載體微球采用熒光微球，由于微球熒光負(fù)載不均勻、穩(wěn)定性差、容易發(fā)生泄漏、不同熒光波長的熒光效率不同，且熒光染料的成本較高、過程復(fù)雜，在生物醫(yī)學(xué)檢測方面應(yīng)用受限；對微球的要求高，不但要求微球高度均勻，表面官能團(tuán)富集而且能有效、穩(wěn)定的包埋小分子。如何既能實(shí)現(xiàn)多通量同時檢測、又能使操作簡單、檢測信號穩(wěn)定性強(qiáng)、區(qū)分度高，且成本低廉的編碼技術(shù)，一直受到研究人員的廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種易于檢測、準(zhǔn)確區(qū)分，同時實(shí)現(xiàn)多通量檢測的基于聚合物微球變化的編碼檢測方法，可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、藥學(xué)等生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。

本發(fā)明提供了基于聚合物微球變化的編碼檢測方法：

本發(fā)明采用表面偶聯(lián)特異性的抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的聚合物微球，通過免疫反應(yīng)或基因雜交反應(yīng)特異性識別待測樣品中的抗原、抗體、DNA或RNA片段；用表面攜帶熒光物質(zhì)的分子探針與待測的抗體、抗原、DNA或RNA片段特異性偶聯(lián)，使得微球表面呈現(xiàn)熒光顏色；在檢測儀器中檢測熒光信號，與陰性和陽性對照標(biāo)本或已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對比，判斷待測樣品是陰性或是陽性；在檢測儀器中對微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，根據(jù)微球粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)與檢測信息的一一對應(yīng)關(guān)系，從而對待測物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。

所述的聚合物微球是不同交聯(lián)度的致密微球、介孔或微孔球；微球的粒徑為2～30μm，相鄰編碼微球粒徑間隔在1～10μm。